綠茶汁對面部痤瘡抑制的實驗觀察

李媛媛 , 姜辰陽 ,夏 凡, 王 男,王雨昊,汪 紅

(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，成都 610225)

綠茶汁對面部痤瘡抑制的實驗觀察

李媛媛 , 姜辰陽 ,夏 凡, 王 男,王雨昊,汪 紅

(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，成都 610225)

痤瘡是毛囊皮脂腺單位的一種慢性炎癥性皮膚病。表皮葡萄球菌是一種條件致病菌，是痤瘡發(fā)生的重要因素之一。該實驗從面部痤瘡中分離出表皮葡萄球菌，觀察綠茶汁對其是否具有抑制作用。抑菌圈實驗比較綠茶汁對面部痤瘡細(xì)菌(FA)、大腸桿菌、枯草桿菌以及金色葡萄球菌的抑菌效果，實驗結(jié)果顯示，綠茶汁對FA和金色葡萄球菌的抑制效果最為明顯，抑菌圈最清楚。菌種鑒定結(jié)果，F(xiàn)A的主要菌為金色葡萄球菌。通過將不同濃度的綠茶汁與FA混合培養(yǎng)24h，做平板計數(shù)實驗，實驗結(jié)果顯示，綠茶汁對FA的抑制效果隨著綠茶汁濃度的增加而增強(qiáng)。實驗創(chuàng)新思路來源于生活，實驗結(jié)果運用于生活，為廣大因面部痤瘡而煩惱的人們提供了一條新途徑。

綠茶汁；茶多酚；痤瘡；表皮葡萄球菌

1 創(chuàng)新型實驗思路

在這個高節(jié)奏、強(qiáng)壓力的社會中，人們因為各種各樣的原因長面部痤瘡，用過大量的祛痘產(chǎn)品和護(hù)膚產(chǎn)品卻收效甚微，同時，產(chǎn)品中各種化學(xué)物品的副作卻使膚質(zhì)越來越差。學(xué)習(xí)知識的目的就是為了運用知識來造福人類。我們的實驗思路來源于生活，并且給人們防治面部痤瘡提供一種更加健康、便捷的方法。

本實驗所用的材料均是可飲用綠茶，純天然無副作用，綠茶提取物的主要成分為茶多酚(tea polyphenols,TP)。近年來，大量實驗研究證實TP具有抑菌[1]、清除自由基、抗氧化[2]的生物活性，在抗癌[3-5]、降壓、降脂[6]、降血糖等方面均有較好的功效。開設(shè)“綠茶提取物對面部痤瘡抑制的實驗觀察”實驗，學(xué)生對微生物中的金色葡萄球菌致病性有了感性認(rèn)識，并通過平板菌落計數(shù)法和雙層平板法的實驗內(nèi)容，提高學(xué)生的實驗技能。由于實驗內(nèi)容新穎、貼近生活和生產(chǎn)實際，能夠很好地激發(fā)學(xué)生的實驗興趣和創(chuàng)新熱情。因此，該實驗可作為微生物基礎(chǔ)實驗中的創(chuàng)新型實驗，為創(chuàng)新人才提供良好的發(fā)展平臺。

2 實驗儀器與材料

2.1 儀器

BA210型顯微鏡；LRH-250A型生化培養(yǎng)箱；BS224S型電子天平；LDZX-30KBS型高壓滅菌鍋；DHG-9240型電熱干燥箱；SW-CJ-1F型超凈工作臺；BCD-301型冰箱。

2.2 器材

玻璃試管；燒杯；培養(yǎng)皿；移液槍(10 μL、50 μL、1 000 μL、5 mL)；酒精燈；錐形瓶。

2.3 菌種

大腸桿菌(escherichia coli)；枯草桿菌(bacillus subtilis)；金色葡萄球菌(golden staph)；面部痤瘡細(xì)菌(facial acne，F(xiàn)A)。

2.4 培養(yǎng)基與試劑

1)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

2)液體培養(yǎng)基

3)無菌生理鹽水

2.5 菌懸液的制備

將菌接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上，在37oC培養(yǎng)24 h后，吸取1 mL無菌水在大腸桿菌的斜面上，用接種環(huán)鉤分散乳化菌苔，制備菌懸液備用。

3 實驗方法

3.1 痤瘡細(xì)菌的分離

1)用酒精先將痤瘡周圍的皮膚進(jìn)行消毒，再用消毒的解剖針挑取痤瘡的膿包細(xì)菌，采用劃線分離法將其劃線培養(yǎng)，如圖1(a)所示。經(jīng)過多次分離純化得到主要的菌種，如圖1(b)所示。

2)將分離的痤瘡細(xì)菌做簡單染色，鏡檢觀察到面部痤瘡細(xì)菌為球菌，如圖1(c)和圖1(d)所示。經(jīng)四川省重點實驗室——四川大學(xué)微生物與代謝工程實驗室鑒定，F(xiàn)A菌種為Staphylococcus epidermidis ATCC 14990(T)表皮葡萄球菌。

3.2 綠茶汁的制備

稱取綠茶25 g于紗布袋中，將紗布袋口捆綁好放入500 mL燒杯中，加入250 mL蒸餾水用文火熬制30 min。最后，將綠茶汁濃縮到100 mL，用錐形瓶裝好存放于冰箱(4 ℃)備用。

圖1 面部痤瘡提取物的培養(yǎng)和鑒別

3.3 濾紙片法

1)將已滅菌并冷卻至50 ℃左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌平皿中，水平放置并凝固。

2)用無菌移液槍分別吸取0.2 mL的枯草菌、大腸桿菌、金色葡萄球菌和FA菌(均培養(yǎng)18 h)的菌液加入到上述平板中，用無菌三角涂棒涂布均勻。

3)用無菌鑷子將已滅菌的小圓濾紙片(D5 mm)浸入綠茶汁(25 ℃)中浸濕(保證濾紙片所含綠茶汁液量基本一致)，貼在上述平板中。

4)將上述貼好濾紙片的含菌平板倒置放于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察記錄抑菌圈的直徑大小。

3.4 綠茶汁梯度培養(yǎng)

1)取無菌試管7支，依次編號，每管分別加入液體培養(yǎng)基3 mL和FA菌液0.05 mL。

2)除作對照的0號管外，向6支試管(1～6號)分別加入1.60 mL、0.80 mL、0.40 mL、0.20 mL、0.10 mL、0.05 mL綠茶汁。

3)將7支試管的體積用生理鹽水稀釋至5 mL，搖勻，放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后進(jìn)行檢測。

綠茶汁梯度培養(yǎng)按表1所示數(shù)據(jù)進(jìn)行加樣。

3.5 平板計數(shù)法[7]

分別從培養(yǎng)24 h的7支試管中，各取 1 mL培養(yǎng)液于無菌試管中，用生理鹽水稀釋成10-1，同樣的方法稀釋樣為10-2、10-3，根據(jù)情況確定是否稀釋至10-4；將稀釋后的樣液混合均勻，從中取出1 mL，加入培養(yǎng)皿中；將溶解并冷卻至50 ℃左右的平板計數(shù)培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)皿中，每皿約20 mL；左右交換搖勻，待凝固后置于37oC恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，觀察并計數(shù)每皿菌落數(shù)，如圖2所示，再根據(jù)稀釋倍數(shù)計算樣液中細(xì)菌總數(shù)，繪制菌落數(shù)變化曲線。

表1 綠茶汁梯度培養(yǎng)數(shù)據(jù) mL

圖2 FA不同濃度平板計數(shù)結(jié)果

4 實驗結(jié)果與分析

4.1 濾紙片實驗結(jié)果

按3.3所述方法實驗，觀察記錄抑菌圈的直徑大小并繪制如圖3所示的折線圖和如圖4所示的抑菌圈圖。

圖3 FA和對比菌抑菌圈直徑大小折線圖

4.2 濃度梯度實驗結(jié)果

利用平板技術(shù)法對放入茶多酚的細(xì)菌培養(yǎng)液中的細(xì)菌數(shù)量變化進(jìn)行了檢測，繪制的菌落數(shù)變化曲線如圖5所示。

5 結(jié)束語

通過在基礎(chǔ)微生物教學(xué)實驗室開展綠茶提取物對面部痤瘡抑制的實驗探索，成功觀察到綠茶提取液對FA的殺傷作用，并通過測量抑菌圈的直徑大小，說明綠茶汁對FA的殺傷作用最強(qiáng)。同時，對不同濃度的綠茶汁和FA的持續(xù)混合培養(yǎng)液進(jìn)行平板計數(shù)實驗，觀察到菌落的存在及其變化，說明不同濃度的綠茶汁對FA的殺傷作用不同。

圖4 FA和對比菌的生長情況

圖5 FA和綠茶培養(yǎng)液混合培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)的變化

本實驗成功地驗證了綠茶汁對FA的抑制作用，且用平板計數(shù)法很好地找到了適合觀察的濃度區(qū)間，可為開設(shè)基礎(chǔ)微生物學(xué)實驗和環(huán)境微生物學(xué)實驗奠定基礎(chǔ)。

基于綠茶汁液對痤瘡的顯著效果，可以將其投放到護(hù)膚品市場，開發(fā)天然無副作用的改善痤瘡的產(chǎn)品，解決人們對痤瘡的煩惱。

[1]王濟(jì)安.茶湯抑菌作用的實驗報告[J].茶報，1998(1)：12-13.

[2]喬鳳云，陳欣，余柳青，等.抗氧化因子與天然抗氧化劑研究綜述[J].科學(xué)通報，2006，22(3)：332-336.

[3]何皎.茶多酚的藥理學(xué)研究概況[J].數(shù)理醫(yī)藥雜志，1999，12(4)：372-374.

[4]Yang G Y，Liao J，Kin K，et al.Inhbition of growth and induction of apoptosis in human cancer cell lines by tea polyphenols[J]. Carcinogenesis，1998,19(4):611-616.

[5]Cameron A R， Anton S， Melville L，et al. Black tea polyphenols mimic insulin/insulin-like growth factor-1 signalling to the longevity factor FOXO1a[J]. Aging Cell，2008，7 (1): 69-77.

[6]Lin C L，Huang H C， Lin J K. Theaflavins attenuate hepatic lipid accumulation through activating AMPK in human HepG2 cells[J]. The Journal of Lipid Research，2007，48 (11): 2334-2343.

[7]沈萍，陳向東.微生物學(xué)實驗[M].4版.北京：高等教育出版社，2007.

Experimental Observation of Green Tea Extractive on the Inhibition of Staphylococcus Epidermids

LI Yuanyuan, JIANG Chenyang, XIA Fan , WANG Nan, WANG Yuhao, WANG Hong

(College of Life Science, Sichuan University, Chengdu 610065, China)

Acne is a chronic inflammatory skin disease of the pilosebaceous unit. While the major acne bacteria are Staphylococcus epidermidis. It is an opportunistic pathogen and one of the important factors for the occurrence of acne. In this experiment, we isolated staphylococcus epidermidis from facial acne. Then, we observed whether the green tea extractive have the inhibitory effect of staphylococcus epidermidis. Experiment and compared the green tea extractive effectiveness of against main strains of the extractive of facial acne with Escherichia coli, Bacillus subtilis, Golden staph by using inhibition zone, experimental results show that the inhibitory effect of green tea extractive on staphylococcus gold is most evident. By diluting different concentration gradients of green tea extractives blended with acne extractive make tablet counting experiments, experimental results showed inhibitory effects of extractives of green tea extractive for acne with increasing concentration and enhanced, to some a few bacteria survive after suppression of time. Final strain identification and expectations met that major acne bacteria is staphylococcus gold. Experiment of innovative ideas comes from life, the experimental results used in life, for the majority of people worry about facial acne offers a new way.

green tea extract; green tea polyphenols; acne; staphylococcus- epidermidis

2014-10-17；修改日期: 2015-01-04

四川大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新實驗基金資助項目(2013-2014)。

李媛媛(1993-)，女，本科在讀， 專業(yè)方向：生物科學(xué)。

汪 紅(1961-)，女，學(xué)士，高級實驗師，主要從事微生物學(xué)實驗教學(xué)工作。

R

Adoi:10.3969/j.issn.1672-4550.2015.01.070