采后β-氨基丁酸處理對梨果實黑斑病的抑制

董柏余,葛永紅,畢 陽,李海杰,龔 迪

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

采后β-氨基丁酸處理對梨果實黑斑病的抑制

董柏余,葛永紅,畢 陽*,李海杰,龔 迪

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

本文研究了采后β-氨基丁酸(BABA)處理對蘋果梨損傷接種互隔交鏈孢(Alternariaalternata)果實病斑擴展以及苯丙烷代謝的影響。結(jié)果表明,50μg/mL的BABA可有效抑制損傷接種果實病斑直徑的擴展;用BABA浸泡果實10min,以及處理和損傷接種間隔12h的處理效果最佳。果實經(jīng)BABA處理后,體內(nèi)的苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性明顯提高,總酚和類黃酮含量也顯著增加。由此表明,BABA可通過誘導(dǎo)果實體內(nèi)的苯丙烷代謝來增強對黑斑病的抗性。

梨,互隔交鏈孢,β-氨基丁酸,采后病害

蘋果梨(Pyruspyrifoliacv. Pingguoli)是我國北方寒溫帶地區(qū)的著名水果,但其易遭受互隔交鏈孢(Alternariaalternata)侵染而發(fā)生黑斑病[1]。雖然化學(xué)殺菌劑可有效控制黑斑病,但由于其殘留危害、病原物產(chǎn)生抗藥性,以及環(huán)境污染等問題而受到限制[2]。因此,開發(fā)新的、更加安全有效的采后病害控制方法顯得十分必要[3]。β-氨基丁酸(β-aminobutyric acid,BABA)是一種非蛋白氨基酸[4],具有誘導(dǎo)多種作物的抗病能力[5]。此外,BABA還可誘導(dǎo)蘋果對青霉病[6]、馬鈴薯對干腐病和晚疫病[7-8],以及番茄對晚疫病的抗性[9]。BABA對采后病害的抗性誘導(dǎo)涉及活性氧代謝與病程相關(guān)蛋白的積累等方面[10-11],桔和蘋果經(jīng)BABA處理后過氧化物酶(POD)與苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性都有顯著提高[12-13]。雖然已經(jīng)有研究表明BABA可誘導(dǎo)梨對青霉病的抗性[14],但尚未見其對梨黑斑病誘導(dǎo)抗性的報道。

本研究以蘋果梨為試材,探索采后BABA不同濃度處理以及不同浸泡時間,不同損傷接種間隔時間對其采后病害的控制效果,并分析處理對果實PAL活性、類黃酮和總酚類含量的影響,為BABA在采后病害控制中的進一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘋果梨 花后100d采自甘肅省景泰縣條山農(nóng)場,單果套發(fā)泡網(wǎng)袋后入標準包裝箱。隔天運抵農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院采后生物學(xué)與技術(shù)實驗室,在室溫(20±2℃;RH 55%～60%)下貯藏待用;互隔交鏈孢(A.alternata) 分離自自然發(fā)病的蘋果梨果實,純化后用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基保存,使用前于PDA培養(yǎng)基25℃下活化培養(yǎng)7d;β-氨基丁酸 天津市光復(fù)精細化工研究所,分析純。

UV-2450紫外分光光度計 日本島津;YXJ-2離心機 湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 孢子懸浮液的配制 參照刁春英方法[15]。取25℃下培養(yǎng)10d的帶菌PDA平皿一個,加入含0.05% Tween80的無菌水約10mL,用玻璃棒刮下PDA平板上的病原菌孢子,然后轉(zhuǎn)入50mL三角瓶中,在WYX-A微型旋渦混合器上振蕩15s,再用雙層紗布過濾,濾液用血球計數(shù)板計數(shù)算出孢子懸浮液的濃度,最后稀釋至所需濃度(1×106CFU/mL)。

1.2.2 BABA處理濃度篩選 將表面用自來水沖洗干凈的果實分別在50、250、500μg/mL的BABA中浸泡10min,取出晾干后在室溫下存放,12h后接種A.alternata孢子懸浮液(1×106CFU/mL),入包裝箱于常溫((20±2)℃;RH 55%～60%)下貯藏待用。以清水處理為對照。每處理用果實15個,重復(fù)3次。

1.2.3 浸泡時間篩選 果實在50μg/mL的BABA溶液中分別浸泡5、10、15min,自然風干后在室溫下存放,12h后損傷接種A.alternata孢子懸浮液(1×106CFU/mL),并置于((20±2)℃;RH55%～60%)下貯藏待用。

1.2.4 接種時間篩選 果實用50μg/mL BABA溶液處理10min,分別于處理后12、24、48h損傷接種A.alternata孢子懸浮液(1×106CFU/mL),接種后的果實置于室溫((20±2)℃;RH 55%～60%)下貯藏待用。

1.2.5 病斑直徑測定 選取上述處理的果實定期觀察并用十字交叉法測量病斑直徑。每處理用果實15個,重復(fù)3次。

1.2.6 苯丙烷代謝關(guān)鍵酶活性和產(chǎn)物含量的測定

1.2.6.1 取樣 分別于BABA處理后第0、2、4、6、8、10d取皮下2～5mm處果肉組織3g。組織用錫箔紙包好,液氮冷凍,在-80℃超低溫冰箱中保存待測。

1.2.6.2 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的測定 參照Yin等方法[16]并修改。稱取3g果肉組織,加入3mL經(jīng)4℃預(yù)冷的、0.2mol/L、pH8.8的硼酸緩沖液(含1% PVPP,1mmol/L EDTA和50mmol/L β-琉基乙醇),在冰浴條件下研磨成勻漿,于4℃、15000×g離心20min,上清液立即用于酶活測定。PAL酶促反應(yīng)體系包括:2mL,pH8.8的硼酸緩沖液(0.2mol/L),300μL粗酶液和lmL、0.02mol/L的L-苯丙氨酸。24℃下反應(yīng)2min時,在紫外可見分光光度儀上測其OD290?？瞻滓耘鹚峋彌_液代替酶液。酶活以每分鐘內(nèi)OD290變化0.01為1個活性單位(U),酶活性以U·mg protein-1表示。實驗重復(fù)3次。酶提取液中蛋白質(zhì)含量利用考馬斯亮藍法進行測定。

1.2.6.3 總酚和類黃酮含量的測定 參照Pirie and Mullins[17]的方法并加以修改。取-80℃冷凍的果肉組織3g,加入預(yù)冷的1% HCl-甲醇溶液5mL,冰浴下充分研磨成勻漿,將勻漿液移入離心管內(nèi)置于暗處4℃下放置20min,進行提取。然后在4℃ 10000×g下離心15min,上清液即可用于總酚和類黃酮含量的測定。取上清液分別在280nm(總酚)和325nm(類黃酮)下測定其吸OD 值,總酚含量用ΔOD280/g FW表示;類黃酮含量用ΔOD325/g FW表示。實驗重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

部分實驗數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進行鄧肯氏多重差異分析(p<0.05)。用 Excel 2007 軟件計算標準偏差并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 BABA處理對果實病斑直徑的影響

圖1 BABA處理對蘋果梨果實損傷接種A.alternata病斑直徑的影響Fig.1 Effect of BABA treatment on lesion diameter of pear fruit注:A為不同濃度,B為不同浸泡時間,C為不同損傷接種間隔時間;圖中豎線表示標準偏差(±SE),同一時間不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

果實經(jīng)三種濃度BABA處理后,其中只有50μg/mL處理可顯著降低果實損傷接種A.alternata的病斑直徑(p<0.05),其病斑直徑比對照低20.4%(圖1A)。當浸泡時間為10min時處理顯著低于對照(p<0.05),病斑直徑比對照低15.4%(圖1B)。當處理與損傷接種的間隔時間為12h時與對照組相比有顯著差異(p<0.05),處理組病斑直徑低于對照組18.2%(圖1C)。

2.2 BABA處理后果實PAL活性和總酚、類黃酮含量的變化

BABA處理可顯著提高果實的PAL活性,處理組與對照組均呈先上升后下降的趨勢,處理組在第2d達到最大,高出同期對照54.7%(圖2A)。處理組果實總酚含量在第2d時達到最大值隨后基本保持平穩(wěn)的趨勢,其中在第2d時高出對照14.7%(圖2B)。處理組與對照組類黃酮含量變化趨勢與總酚變化趨勢類似,其中處理組類黃酮含量在貯藏第2d達到最大值,高出對照組14.1%(圖2C)。

圖2 50μg/mL BABA處理對蘋果梨果實PAL活性、總酚含量和類黃酮含量的影響Fig.2 Effect of BABA at 50μg/mL on activity of PAL and accumulation of phenolics,flavonoidin pear fruit

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明,采后50μg/mL BABA處理可通過誘導(dǎo)果實苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶活性及產(chǎn)物的積累來提高蘋果梨對黑斑病的抗性。這與采后BABA處理可以提高桔[18]與蘋果[6,19]的抗病能力的研究結(jié)果相類似。PAL是苯丙烷類代謝途徑中的第一個關(guān)鍵酶,與植保素、木質(zhì)素及酚類化合物的形成密切相關(guān),在PAL的作用下,苯丙氨酸脫氨基可以生成酚類和其他具有抗菌活性的物質(zhì),它們對抑制病原菌具有明顯的作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn),BABA處理顯著提高了果實的PAL活性(圖2A),這與BABA處理后明顯提高馬鈴薯[7]、梨[14]、芒果[16]以及桔[18]PAL活性的結(jié)果一致。酚類和類黃酮是苯丙烷代謝的末端產(chǎn)物,具有一定的抗菌作用,酚類化合物被氧化后形成毒性更強的醌類物質(zhì),能有效抑制病原物的擴展。此外,酚類物質(zhì)還是木質(zhì)素等抗病物質(zhì)合成的前體[21-23]。類黃酮具有明顯抗微生物活性,可抑制孢子萌發(fā)、芽管伸長、菌絲生長[24]。本研究結(jié)果顯示,BABA處理可顯著提高果實總酚和類黃酮的含量(圖2B,圖2C)。這說明BABA處理可明顯激活酚類和類黃酮合成途徑,加速植保素的合成和木質(zhì)化的形成進程,以增加果實對病原物抵抗能力。這與BABA處理馬鈴薯塊莖明顯提高總酚類物質(zhì)含量的結(jié)果一致[7]。

當BABA浸泡時間為10min時,對A.alternata的抑制效果最佳,而浸泡時間為5min抑制效果不明顯,可能是由于浸泡時間過短導(dǎo)致BABA滲入果實組織的濃度不夠,沒能有效激發(fā)果實的抗性(圖1B)。另外,本實驗還發(fā)現(xiàn)在BABA處理后間隔12h損傷接種A.alternata的抑制效果要好于間隔24h和48h(圖1C),這可能與BABA誘導(dǎo)的抗性周期相關(guān),說明處理后間隔12h比間隔24h和48h誘導(dǎo)了更強的抗性。但BABA對蘋果梨果實的誘導(dǎo)抗性周期如何變化,以及更深入的誘抗機理尚有待進一步研究。

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Effect of the postharvest β-aminobutyric acid treatment on the inhibiton of fruit alternaria rot of pear fruit

DONG Bo-yu,GE Yong-hong,BI Yang*,LI Hai-jie,GONG Di

(College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Effect of β-aminobutyric acid(BABA)dipping on lesion development of pear fruit inoculated withAlternariaalternataand potentiation of phenylpropanoid pathway was investigated in this paper. The results indicated that the lesion diameter of pear inoculated withA.alternatawas significantly decreased when BABA at 50μg/mL,and the smallest lesion diameter was determined in the fruit treated for 10min. In addition,the interval of treatment and inoculation also affected lesion development,and with inoculation the fruit 12h after treatment showed the best result. Further studies showed that BABA increased phenylalanine ammonia lyase(PAL)activity,accumulated the total content of phenolic and flavonoids in the fruit during storage. It was suggested that BABA treatment inhibited Alternaria rot of pear by enhancing phenylpropanoid pathway in fruits.

pear;alternariaalternata;β-aminobutyric acid(BABA);postharvest diseases

2014-05-19

董柏余(1986-),男,碩士研究生,研究方向：果蔬采后生物學(xué)與技術(shù)。

*通訊作者:畢陽(1962-),男,博士,教授,研究方向：果蔬采后生物學(xué)與技術(shù)。

新型蓄冷保溫技術(shù)與設(shè)備(2013BAD19B01)。

TS255.3

A

1002-0306(2015)07-0320-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.058