葡萄酒中外源性天然色素摻偽檢測

趙廣西,劉 浩,李志芬,杜 偉,楊 帛,張克義

(1.國家葡萄、葡萄酒質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(秦皇島),河北秦皇島 066000；2.秦皇島市食品藥品檢驗中心,河北秦皇島 066000)

葡萄酒中外源性天然色素摻偽檢測

趙廣西1,劉 浩1,李志芬2,杜 偉1,楊 帛1,張克義1

(1.國家葡萄、葡萄酒質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(秦皇島),河北秦皇島 066000；2.秦皇島市食品藥品檢驗中心,河北秦皇島 066000)

研究確定了葡萄酒中可能添加的天然色素種類是花青素類物質(zhì),并建立了葡萄酒中花色苷的檢測方法,樣品經(jīng)SPE提取后高效液相色譜熒光法進行定性、定量分析。確定了葡萄酒中6種主要呈色物質(zhì)：錦葵素-3-葡萄糖苷；錦葵素-3-乙酰葡萄糖苷；錦葵素-3-p-香豆酰葡萄糖苷；芍藥素-3-葡萄糖苷;飛燕草素-3-葡萄糖苷；矮牽牛色素-3-葡萄糖苷,比例分別為5∶1.5∶1∶0.5∶0.4∶0.4,當酒中原有花色苷種類和比例出現(xiàn)劇烈變化時,即可判定添加了外源花色苷,方法可以有效判定酒中是否添加外源花色苷。

高效液相色譜法,鑒別檢測,天然色素

天然色素是由天然資源獲得的食用色素。天然色素不僅給予食品增添了風味,而且相當部分具有一定的生理活性。目前,開發(fā)利用天然色素,已成為食品、化妝品業(yè)的發(fā)展趨勢。尤其是歐美一些發(fā)達國家在食品中使用天然色素的比例已達 85%,并有完全取代合成色素的趨勢,在我國每年生產(chǎn)的食品色素中天然色素也占了90%[1-3]。但天然色素也存在嚴重的濫用、亂用問題。因此市場上存在著大量天然色素調(diào)色產(chǎn)品,其以次充好,以假亂真,造成了市場的混亂。

食品天然色素主要來源于植物色素,根據(jù)其化學結(jié)構(gòu),分為花青素、類胡蘿卜素、葉綠素。其中花青素類色素水溶性好,在微酸條件下對光、熱條件變化的反應(yīng)比較穩(wěn)定且自然界植物資源豐富。尤其是主要為農(nóng)副產(chǎn)品綜合利用,價格低廉、成本低,如紅米色素、黑豆皮素、蘿卜紅、葡萄皮、越橘紅、黑加侖、紅玫瑰茄色素等,是果酒中常用的著色劑[4]。

目前花青素主要檢測方法有層析法[5]、分光光度法[6]、液相色譜法[7-11]、液質(zhì)聯(lián)用法[12-15]等。其中層析法、分光光度法難以實現(xiàn)對多種色素的同時檢測。高效液相色譜-質(zhì)譜法儀器昂貴,保養(yǎng)使用精細。高效液相色譜法方法簡單,重復(fù)性好,結(jié)果準確,是目前主要方法。

本文研究利用高效液相色譜法測定葡萄酒中主要花色苷含量和比例,比較了添加外源色素后對酒中原有色素含量和比例的變化,確定葡萄酒中外源色素通用檢測方法,為葡萄酒的檢測提供有效的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙腈、甲醇 色譜純,迪馬公司;甲酸、三氟乙酸、氨水 分析純,天津市化學試劑三廠；錦葵色素-3-葡萄糖苷、錦葵素-3-p-香豆酰葡萄糖苷、錦葵素-3-乙酰葡萄糖苷、飛燕草素-3-蕓香糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷、矮牽牛色素-3-葡萄糖苷 Sigma公司;Cleanert PCX(6mL/500mg) 天津博納艾杰爾科技有限公司。

表2 葡萄酒中12種花色苷

葡萄酒樣品：昌黎當?shù)刭徺I。

Agilent 1100高效液相色譜儀，配有紫外檢測器 美國安捷倫公司；IKA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex C184.6mm×250mm,4μm；柱溫箱溫度：30℃；流動相：水+甲酸(95+5)(A)和甲醇+乙腈+水+甲酸(22.5+22.5+45+5)(B),梯度洗脫,見表1；流速：1mL·min-1；進樣量：10μL；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：520nm。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.2.2 樣品處理 取5mL酒樣過2%三氟乙酸12mL活化后的Cleanert PCX小柱,酸化甲醇12mL清洗雜質(zhì),5%氨水-甲醇(40:60)6mL洗脫,收集洗脫液加甲酸調(diào)節(jié)pH到2后旋蒸定容5mL,用0.45μm的超濾膜過濾提取液,供分析用[16-17]。

1.2.3 標準溶液的配制 取適量標品在超純水溶解后定容,配制成10、50、100、500mg/L的標準溶液,置于4℃冰箱中備用。

1.2.4 檢出限 選10mg/L色素標準品溶液,進行測定,方法的檢出限(LOD)定義為產(chǎn)生3倍信噪比(S/N=3)的化合物的質(zhì)量濃度,信噪比S/N=3 時,計算檢出限。

1.2.5 添加回收率及重復(fù)性 對不同質(zhì)量濃度的色素標準品在同一天內(nèi)連續(xù)進樣 6 次,所得峰面積計算相對標準偏差(RSD)；取5mL酒樣加入不同濃度的色素標準品配成加標樣品,搖勻后靜置,按照1.2.2提取方法進行加標回收試驗。

1.2.6 樣品測定 在1.2.1條件下,分別將標準溶液和待測液注入高效液相色譜儀中,以保留時間定性,以待測液峰面積與標準溶液峰面積比較定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

葡萄酒中的花色苷主要為矢車菊素、飛燕草素、錦葵色素、甲基花青素以及矮牽牛苷配基5種花色素誘導體。研究對紅葡萄酒進行大量檢測,實驗認為葡萄酒中花色苷主要為飛燕草素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、矮牽牛-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵色素-3-葡萄糖苷、翠雀素-3-乙酰葡萄糖苷、花青素-3-乙酰葡萄糖苷、矮牽牛-3-乙酰葡萄糖苷、甲基花青素-3-乙酰葡萄糖苷、錦葵色素-3-乙酰葡萄糖苷、甲基花青素香豆素-3-葡萄糖苷、錦葵色素-3-香豆酰葡萄糖苷12種。

其中錦葵色素-3-葡萄糖苷、錦葵色素-3-乙酰葡萄糖苷和錦葵色素-3-p-香豆酰葡萄糖苷含量最多,其次是芍藥素-3-葡萄糖苷、飛燕草素-3-葡萄糖苷和矮牽牛色素-3-葡萄糖苷等。由于這六種花色苷含量最高,因此選取這六種花色苷作為主要研究對象。

2.2 花色苷的光譜分析

花色苷是類黃酮化合物,在280nm和520nm左右的兩個波長處有特征吸收峰,而干擾花色苷分析的其他類黃酮化合物(如黃酮、黃烷酮、黃酮醇、黃烷醇等)在紫外區(qū)300～350nm和240～285nm有特征吸收峰。而實驗發(fā)現(xiàn)12種花色苷其最大吸收波長略有差異,但在520nm波長處均有較強的吸收,為兼顧靈敏度,選擇520nm為檢測波長[18-20]。

2.3 固相萃取

表3 色素的回歸分析結(jié)果和相關(guān)系數(shù)

簡單過濾的樣品中含有一定量糖、酸、鹽,而且樣品中的酚類成分往往干擾檢測,樣品分析前的凈化,將會大大提高靈敏度,并使基線更加平穩(wěn)。

本文比較了Sep-Pak-C18反相C18柱；Cleanert PCX陽離子交換混合機理柱；陽離子和反相C18混合柱[21-23]。C18通用型硅膠基質(zhì)鍵合相C18小柱,具有強疏水性,能從水相中吸附弱疏水性的分析物,與反相HPLC柱相似，回收率在65%左右。Cleanert PCX是以陽離子交換混合機理的水可浸潤型聚合物為基質(zhì)的萃取柱。提供離子交換與反相保留柱,可在酸性條件下與由于花色苷的堿性基團相互作用,而環(huán)境變?yōu)閴A性時,結(jié)合被迅速破壞從而被迅速、徹底的洗脫,因此對花色苷類有著較好回收率為93%左右。

2.4 色譜柱的選擇

色譜柱的選擇是檢測的先決條件,對整個檢測結(jié)果影響重大,花色苷檢測色譜柱主要可分為三種：傳統(tǒng)C18柱、苯基柱、離子交換和反相C18混合柱。C18柱主要以C18的C-H與花色苷分子間通過范德華力產(chǎn)生保留,是花色苷的傳統(tǒng)分離柱。苯基柱通過苯基固定相的π電子與花色苷分子的π電子發(fā)生作用產(chǎn)生保留。離子交換和反相C18混合模式柱具有疏水作用和離子交換的雙重機理,在C18柱基礎(chǔ)上,在酸性環(huán)境中固定相與花青素分子極性相反,相互作用,分離度極好[24]。針對三種不同類型色譜柱，分別選取C18柱Phenomenex Synergi Hydro-RP 4.6mm×250mm；苯基柱Agilent Eclipse Plus 4.6mm×250mm；混合柱Thermo Scientific Accucore 2.1mm×150mm,進行比較。

實驗表明三種色譜柱均能對主要花色苷實現(xiàn)較好分離,但對含量較少的花色苷分離有所差別。如芍藥素-3-葡萄糖苷和錦葵花色素-3-O-葡萄糖；矢車菊素-3-葡萄糖苷和飛燕草-3-葡萄糖苷的分離；牽牛色素-3-葡萄糖苷和矢車菊素阿拉伯糖苷。通過綜合比較,選取了Phenomenex Synergi Hydro-RP柱。

2.5 流動相選擇

在反相色譜系統(tǒng)中花色苷的分離主要取決于分子極性和化學結(jié)構(gòu)[25]。由于花色苷都是酸穩(wěn)定型而且酸性環(huán)境中520nm下的吸收最好。因此試驗中首先選取了甲醇-磷酸、甲醇-甲酸、甲醇-三氟乙酸進行檢測,以甲酸效果最好。

在實驗過程中,嘗試不同比例的流動相。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當乙腈比例高時,出峰時間過早,與溶劑峰太近難以區(qū)分,分離效果不好；而當乙腈所占比例為低時,雖然分離效果明顯,但出峰時間過長。經(jīng)多次試驗后,并參考資料最終選用甲醇-乙腈-水混合體系進行洗脫[26-29]。以水+甲酸(95+5)(A)和甲醇+乙腈+水+甲酸(22.5+22.5+45+5)(B)為流動相,能有效的起到分離的效果。

在此體系下,質(zhì)子溶劑水、甲醇和極性非質(zhì)子溶劑乙腈相混合,各個組分得到了良好的分離,色譜的選擇性和洗脫強度都有所提高,對各組分的分離度較高且峰形對稱性良好。

2.6 柱溫

研究對30～55℃進行了多次實驗。實驗表明,隨著溫度的升高,分離度有輕微的下降,而且對比30℃和55℃,當溫度升高時部分花色苷沒有分離或分離度下降。同時柱溫的不同也影響到出峰的順序。

2.7 方法學考察

2.7.1 線性方程和相關(guān)系數(shù) 將配制系列質(zhì)量濃度的標準溶液按照1.2.1色譜條件檢測,測定各質(zhì)量濃度樣品的峰面積,以質(zhì)量濃度X(mg/mL)對峰面積Y進行線性回歸分析,線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)如表3所示。

圖1 昌黎赤霞珠葡萄酒中六種花色苷檢測Fig.1 6 anthocyanins in dry red wine of cabernet sauvignon in changli

2.7.2 檢出限、回收率及重復(fù)性 對不同質(zhì)量濃度的色素標準品在同一天內(nèi)連續(xù)進樣 6 次,所得峰面積的相對標準偏差(RSD)為2.7%～3.5%,表明該方法具有較好的精密度。方法的檢出限(LOD)定義為產(chǎn)生3倍信噪比(S/N=3)的化合物的質(zhì)量濃度,選10mg/L色素標準品溶液,進行測定,信噪比S/N=3 時,檢出限如下,實驗結(jié)果表明本方法的靈敏度較高,能滿足對色素檢測和摻假控制的要求。

表5 昌黎赤霞珠葡萄酒中六種花色苷含量分析

2.8 紅葡萄酒中六種花色苷含量和比例

2.8.1 當?shù)丶t葡萄酒中六種花色苷的檢測 按照1.2.1的方法,選取不含外源色素的葡萄酒的5組樣品進行色素含量檢測,確定酒中主要是6種色素，含量分別為錦葵素-3-葡萄糖苷在420～485mg/kg；錦葵素-3-乙酰葡萄糖苷125～145mg/kg；錦葵素-3-香豆酰葡萄糖苷62～92mg/kg；芍藥素-3-葡萄糖苷24～56mg/kg；飛燕草素-3-葡萄糖苷33～56mg/kg；矮牽牛色素-3-葡萄糖苷32～55mg/kg；比例為50∶16∶8∶4∶4∶4,結(jié)果與文獻基本相符[30-31]。

表4 樣本的回歸分析結(jié)果和檢出限

2.8.2 添加紅米紅色素后紅葡萄酒中矢車菊素-3-葡萄糖苷和芍藥素-3-葡萄糖苷含量和比例 從表5可知葡萄酒中6種主要色素，而紅米紅色素中主要呈色物質(zhì)為矢車菊素-3-葡萄糖苷和芍藥素-3-葡萄糖苷。向葡萄酒樣品中添加紅米紅色素觀察結(jié)果。

表6 五種天然色素及其主要呈色物質(zhì)

方法中基線在開始時歸零,并隨時間延長不斷降低,在圖2中時間為32min開始所以基線值低于“0”。

圖2 昌黎赤霞珠葡萄酒中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷/芍藥素-3-O-葡萄糖苷含量Fig.2 Content of Cyaniding-3-glucoside and Peonidin-3-glucoside in Cabernet Wine

圖3 昌黎赤霞珠葡萄酒中添加外源紅米紅色素30mg·kg-1檢出圖Fig.3 The content of 30mg·kg-1 back rice pigmen in cabernet wine

試驗確定添加微量的紅米紅色素,葡萄酒中的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素-3-O-葡萄糖苷的比值即會發(fā)生巨大變化,添加量越大比值變化越大。圖3為昌黎赤霞珠葡萄酒中添加外源紅米紅色素30mg·kg-1色譜圖。

2.8.3 市場樣品測定 在市場購買15款干紅葡萄酒進行檢測,按照1.2.2的方法進行提取,按照1.2.1的色譜條件進行測定。發(fā)現(xiàn)其中14款的產(chǎn)品中色素比例與表5相一致,僅1款產(chǎn)品中矢車菊素-3-葡萄糖苷和芍藥素-3-葡萄糖苷含量分別為170mg/kg和50mg/kg,矢車菊素-3-葡萄糖苷超過芍藥素-3-葡萄糖苷含量,比例3∶1,與表5的比例有較大差距,因此,判斷酒中添加有主要成色物質(zhì)是矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的紅米紅色素。

3 結(jié)論與討論

我國《GB 15037-2006葡萄酒》標準中明確規(guī)定不得添加合成著色劑,但對天然色素并沒有提及,酒中添加天然色素進行護色著色是葡萄酒行業(yè)的一種經(jīng)常做法,但往往在標識上并不標注,由于我國沒有相應(yīng)檢測方法,許多消費者往往被蒙騙。

天然色素種類多樣,如果每種都建立相應(yīng)的檢測方法,方法必然繁瑣且難以實現(xiàn)對市場的即時反應(yīng)。實驗研究了酒中自身和可能添加的天然色素的類型主要為花青素類物質(zhì),并建立統(tǒng)一的檢測方法,確定了葡萄酒中主要呈色物質(zhì)為錦葵素-3-葡萄糖苷、錦葵素-3-乙酰葡萄糖苷和錦葵素- 3-p-香豆酰葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷、飛燕草素-3-葡萄糖苷和矮牽牛色素-3-葡萄糖苷,并確定互相比例[32-35]。六種物質(zhì)比例基本穩(wěn)定,因此當酒中添加少量的外源天然色素后即會急劇改變酒中花色苷比例或增加新的種類,通過監(jiān)測變化可以判定酒中是否添加外源天然色素。

方法采用快速、簡便、通用的前處理方法與色譜條件,建立了果酒和飲料中天然色素檢測的高效液相色譜方法,可以對市場上絕大多數(shù)天然色素進行檢測,無需專一的方法,適用性強,通用性好,解決了天然色素檢測難題。方法經(jīng)多次實驗證實準確、可靠,適用于實際樣品中多種天然色素的檢測。

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Determination of exogenous natural pigment in wine

ZHAO Guang-xi1,LIU Hao1,LI Zhi-fen2,DU Wei1,YANG Bo1,ZHANG Ke-yi1

(1.National Center of Supervision & Inspection on Grape and Wine Quality,Qinhuangdao 066000,China;2.Qinhuangdao Center For Food and Drug Control;Qinhuangdao 066000,China)

Based on the previous study,natural pigment added to wine were anthocyanins. A method of determining anthocyanins in wine was established. The qualitative and quantitative analysis was investigated by HPLC. 6 major anthocyanins in wine were determined:Mv-3-gl,mv-3-gl-Ac,mv-3-gl-cm,pn-3-gl,df-3-gl and pt-3-gl. Ratio was 5∶1.5∶1∶0.5∶0.4∶0.4. Therefore,when the contents and proportion were varied dramatically,which showed that natural pigment was applicated into wine. This method was effective in distinguishing whether the anthocyanins added in wine.

high performance liquid chromatography;distinguishing and detection;natural pigment

2014-05-04

趙廣西(1979-)，男，碩士，工程師，研究方向：食品安全檢測。

TS201.1

A

1002-0306(2015)07-0290-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.053