HPLC-DAD法測(cè)定通賢柚葉中兩種活性黃酮的含量

黃友秋,趙雪荔,陳 席,游元元,2,*

(1. 成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,四川成都 610083;2. 四川省高校結(jié)構(gòu)特異性小分子藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川成都 610083)

HPLC-DAD法測(cè)定通賢柚葉中兩種活性黃酮的含量

黃友秋1,趙雪荔1,陳 席1,游元元1,2,*

(1. 成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,四川成都 610083;2. 四川省高校結(jié)構(gòu)特異性小分子藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川成都 610083)

目的:建立HPLC-DAD測(cè)定通賢柚葉中柚皮苷與野漆樹苷的方法。方法:色譜柱為Sepax Amethyst C18-H(250×4.60mm,5μm),流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸梯度洗脫,流速1.0mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為283nm(柚皮苷),337nm(野漆樹苷),柱溫25℃,進(jìn)樣量20μL。結(jié)果:柚皮苷與野漆樹苷色譜峰分離良好。二者分別在0.0653～0.6526mg/mL與0.0350～0.3505mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。平均加樣回收率分別為98.68%與98.47%。結(jié)論:所建立的含量測(cè)定方法可用于通賢柚葉的質(zhì)量控制。采收季節(jié)與葉齡對(duì)柚葉中兩種黃酮類物質(zhì)的含量有較明顯的影響。

通賢柚葉,高效液相色譜-二級(jí)管陣列檢測(cè)器,柚皮苷,野漆樹苷,含量測(cè)定

通賢柚為川產(chǎn)地方良種柚。自1929年從福建漳州引種至四川省安岳縣通賢鎮(zhèn)后,經(jīng)過(guò)多年的培育,逐漸成為當(dāng)?shù)氐奶赜衅贩N,并多次獲得全國(guó)柚類質(zhì)量評(píng)比金杯獎(jiǎng)。2011年,通賢柚被批準(zhǔn)為國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品。目前安岳縣已形成百里通賢柚產(chǎn)業(yè)帶,2013年全縣通賢柚栽種面積為3.4萬(wàn)畝。

為了培養(yǎng)合理的豐產(chǎn)樹形、平衡生長(zhǎng)與結(jié)果的關(guān)系并培育優(yōu)良母枝,通賢柚樹每年都需修枝剪葉,由此產(chǎn)生了大量廢棄柚葉?！侗静菥V目》記載柚葉具有行氣止痛、解毒消腫之效,主治頭風(fēng)痛、寒濕痹痛、食滯腹痛、乳癰等癥。柚葉中含有柚皮苷(naringin)與野漆樹苷(rhoifolin)等黃酮類物質(zhì)。柚皮苷具有抗腫瘤[1-2]、抗炎[3]、抗氧化[4]、降血脂[5-6]、調(diào)節(jié)血糖[7-8]等活性,而野漆樹苷對(duì)肝損傷有保護(hù)作用,也能調(diào)節(jié)血糖[9-10]。為了充分利用通賢柚葉的藥用價(jià)值,本實(shí)驗(yàn)對(duì)通賢柚葉中柚皮苷與野漆樹苷兩種活性黃酮類物質(zhì)進(jìn)行了含量測(cè)定,為通賢柚資源的綜合利用提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DionexU3000型高效液相色譜儀 美國(guó)戴安公司;BP1215電子天平 Sartorius公司;Rios純水器 密理博上海貿(mào)易有限公司;AS5150BD-I超聲波清洗器 天津奧特賽恩斯儀器有限公司;Anke TGL-16G離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

柚皮苷對(duì)照品 成都曼思特生物科技有限公司;野漆樹苷對(duì)照品 成都曼思特生物科技有限公司。色譜純乙腈 美國(guó)Sigma-Aldrich;分析純甲醇、分析純甲酸 成都市科龍化工試劑廠;水為自制超純水。

通賢柚葉采集自安岳縣通賢柚地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)產(chǎn)地范圍。洗去表面雜質(zhì)與灰塵,自然陰干后粉碎,過(guò)60目篩備用。樣品來(lái)源見表1。

表1 樣品來(lái)源

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取柚皮苷、野漆樹苷對(duì)照品適量,分別置10mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,配成濃度分別為1.004mg/mL與1.001mg/mL的對(duì)照品貯備液。

分別精確移取柚皮苷、野漆樹苷對(duì)照品貯備液3.25mL與1.75mL,同置5mL容量瓶中,得到濃度分別為0.6526mg/mL與0.3504mg/mL的混合對(duì)照品溶液A。分別精確移取柚皮苷、野漆樹苷對(duì)照品貯備液2.6mL與1.4mL,同置5mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,得到濃度分別為0.5221mg/mL與0.2803mg/mL的混合對(duì)照品溶液B。精確移取混合對(duì)照品溶液B 2.5mL,置5mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,得混合對(duì)照品溶液C。精確移取混合對(duì)照品溶液C 2.5mL,置5mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,得混合對(duì)照品溶液D。精確移取混合對(duì)照品溶液D 2.5mL,置5mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,得混合對(duì)照品溶液E。

1.2.2 供試品溶液的配制 取各通賢柚葉樣品細(xì)粉約3.0g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入50%甲醇40mL,浸泡過(guò)夜,超聲提取30min,補(bǔ)足減失質(zhì)量。提取液離心(2500r/min)10min,取上清液以0.22μm微孔濾膜濾過(guò),取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.2.3 色譜條件 色譜柱:Sepax Amethyst C18-H柱(250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1%甲酸(B)梯度洗脫,乙腈的體積分?jǐn)?shù)配比:0～15min為14%→16%,15～35min為16%→17%,35～45min為17%→19.5%,45～70min為19.5%→23%;流速為1.0mL/min;柚皮苷檢測(cè)波長(zhǎng)為283nm,野漆樹苷檢測(cè)波長(zhǎng)為337nm;柱溫:25℃;進(jìn)樣量為20μL;采樣時(shí)間70min?；旌蠈?duì)照品和通賢柚葉樣品分離的色譜圖見圖1。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 分別取混合對(duì)照品溶液A、B、C、D、E各20μL進(jìn)樣,記錄峰面積。以峰面積(A)對(duì)樣品濃度(C)進(jìn)行線性回歸,得到2種黃酮化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)與線性范圍。

1.2.5 方法學(xué)考察 精密度實(shí)驗(yàn):取14號(hào)樣品,按1.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按1.2.3項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn):取14號(hào)樣品共6份,按1.2.2項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液,按1.2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄峰面積并計(jì)算含量。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):取14號(hào)樣品供試品溶液,在0、1.5、3、4.5、6、7.5、12、36h分別進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積。

回收率實(shí)驗(yàn):精密稱取已知含量的14號(hào)樣品約1.5g,共6份,精密加入含有柚皮苷2.487mg/mL與野漆樹苷1.847mg/mL的混合對(duì)照品溶液1.45mL,混勻,揮干甲醇液后按1.2.2項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液,按1.2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄峰面積。

1.2.6 含量測(cè)定 取各通賢柚葉粉末樣品,按1.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按1.2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,測(cè)定各分析物的峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

實(shí)驗(yàn)采用100%甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇作為提取溶劑,結(jié)果表明以50%甲醇溶液提取時(shí)柚皮苷及野漆樹苷峰面積最大,故選用50%甲醇作為提取溶劑。此外,考察了超聲提取20、30、40、50min的提取效果,結(jié)果表明30min超聲提取能使化學(xué)組分被充分提出。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

用二極管陣列檢測(cè)器(DAD)在實(shí)驗(yàn)條件下分析了柚皮苷與野漆樹苷對(duì)照品色譜峰的紫外光譜,其λmax分別為283、337nm,故選擇這兩個(gè)波長(zhǎng)分別作為兩個(gè)待測(cè)成分的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 兩種待測(cè)組分的分離情況

柚皮苷與野漆樹苷混合對(duì)照品及通賢柚葉樣品分離的色譜圖見圖1,在本實(shí)驗(yàn)條件下兩種黃酮類物質(zhì)的色譜峰分離良好。

2.4 線性關(guān)系考察結(jié)果

柚皮苷與野漆樹苷含量測(cè)定的回歸方程、相關(guān)系數(shù)與線性范圍見表2。

表2 2種黃酮類化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)與線性范圍

2.5 方法學(xué)考察結(jié)果

精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。柚皮苷與野漆樹苷峰面積的RSD分別為0.31%與1.34%,表明精密度良好。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。柚皮苷與野漆樹苷含量的RSD分別為0.84%與1.70%,表明重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。柚皮苷與野漆樹苷峰面積的RSD分別為1.28%與1.90%,表明供試品溶液在36h內(nèi)穩(wěn)定。

表5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

回收率計(jì)算結(jié)果見表6。柚皮苷與野漆樹苷的平均回收率分別為98.68%與98.47%,RSD分別為2.54%與1.48%。

2.6 樣品含量測(cè)定結(jié)果

以外標(biāo)法計(jì)算23個(gè)樣品中柚皮苷與野漆樹苷的含量,結(jié)果見表7。

3 結(jié)論與討論

23個(gè)通賢柚葉所含柚皮苷含量為1.56%～5.63%,野漆樹苷含量為0.66%～2.65%。夏末秋初采摘的葉片中所含的2種活性黃酮物質(zhì)含量普遍高于冬季采摘樣品。此外,葉齡對(duì)2種成分的含量也有影響,修枝所得柚葉多為新長(zhǎng)出的嫩葉,其含量高于長(zhǎng)期無(wú)人管理、修剪的老葉。通賢鎮(zhèn)四方村為通賢柚科技園區(qū),栽培技術(shù)更為規(guī)范,其葉片所含兩種活性物質(zhì)的含量較高。

文獻(xiàn)報(bào)道柚葉中含有柚皮苷元(柚皮素)[11-12],但本實(shí)驗(yàn)并未在通賢柚葉中發(fā)現(xiàn)柚皮素。推測(cè)是由于通賢柚與文獻(xiàn)報(bào)道的柚樹品種不同,且生長(zhǎng)環(huán)境特征相異,導(dǎo)致柚葉中累積的次生代謝產(chǎn)物有別。

表6 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表7 樣品含量測(cè)定結(jié)果

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Determination of two flavonoids in Tongxian grapefruit leaves by HPLC-DAD

HUANG You-qiu1,ZHAO Xue-li1,CHEN Xi1，YOU Yuan-yuan1,2,*

(1.Pharmaceutical College,Chengdu Medical College,Chengdu 610083,China;2.Key Laboratory of Structure-specific Small Molecule Drug Research of Sichuan Province,Chengdu 610083,China)

Objective:To develop a HPLC-DAD method to determine the content of naringin and rhoifolin in Tongxian grapefruit leaves. Methods:HPLC was performed on a Sepax Amethyst C18-H analytical column(250mm×4.60mm,5μm)with gradient elution using acetonitrile and 0.1% aqueous formic acid as the mobile phase at a flow rate of 1.0mL/min. The detection wavelength was 283nm for naringin,337nm for rhoifolin. The column temperature was 25℃ and the injection volume was 20μL. Results:The chromatographic peaks of naringin and rhoifolin could be separated well in the above cases. The linear ranges for the two flavonoids were 0.0653～0.6526mg/mL and 0.0350～0.3505mg/mL,respectively. The average recoveries were 98.68% and 98.47%,respectively.Conclusion:The established method could be used for the quality control of Tongxian grapefruit leaves.Harvest season and leaves age affect the content of two flavonoids significantly.

Tongxian grapefruit leaves;HPLC-DAD;naringin;rhoifolin;content assay

2014-06-27

黃友秋(1990-),男,本科,研究方向:藥學(xué)。

*通訊作者:游元元(1974-)，女，博士，副教授，研究方向：中藥品種、品質(zhì)、藥效和資源開發(fā)。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201946)；四川省教育廳科研項(xiàng)目(13ZC074)；四川省“高等教育質(zhì)量工程”建設(shè)項(xiàng)目。

TS209

A

1002-0306(2015)07-0286-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.052