25個(gè)南瓜品種不同溶劑提取物抗氧化活性研究

王士苗,康文藝,孫 麗,周俊國(guó),李新崢,*

(1.河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.河南大學(xué)藥學(xué)院,河南開封 475000)

25個(gè)南瓜品種不同溶劑提取物抗氧化活性研究

王士苗1,康文藝2,孫 麗1,周俊國(guó)1,李新崢1,*

(1.河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.河南大學(xué)藥學(xué)院,河南開封 475000)

采用清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、清除[2,2′-連氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽](ABTS)自由基以及鐵離子還原能力(FRAP)的方法,以BHT為陽(yáng)性對(duì)照藥物,研究25個(gè)南瓜品種的體外抗氧化活性。結(jié)果表明:南瓜提取物清除DPPH自由基能力均較弱;“汕美2號(hào)”乙酸乙酯清除ABTS自由基(IC50=(4.41±0.23)μg/mL)能力最強(qiáng),強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照BHT(IC50=(8.59±0.56)μg/mL);對(duì)于還原Fe3+能力,乙酸乙酯提取物高于其他部位提取物,其中“改良蜜本”乙酸乙酯部位(TEAC=(529.65±69.52)μmol/g)的還原能力弱于陽(yáng)性對(duì)照Trolox(TEAC=(1387.51±37.93)μmol/g)。

南瓜果實(shí),體外抗氧化,DPPH,ABTS,FRAP

正常機(jī)體中自由基氧化作用與抗氧化防御作用處于動(dòng)態(tài)平衡中,但在自由基產(chǎn)生過(guò)多或抗氧化防御系統(tǒng)作用減弱時(shí),體內(nèi)自由基則不能被完全清除而累積進(jìn)而損害機(jī)體,導(dǎo)致一系列相關(guān)疾病,抗氧化劑可以抑制自由基的產(chǎn)生或直接清除自由基。目前食品和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的人工合成抗氧化劑如BHT、BHA等有諸多副作用。因此,近年來(lái)從自然界中尋求天然、安全抗氧化劑已引起研究人員的高度重視。

表1 南瓜序號(hào)與品種、類型、來(lái)源

關(guān)于南瓜的研究多集中于水溶性多糖成分上,且實(shí)驗(yàn)用所南瓜材料大都是隨機(jī)選取,且只選擇某個(gè)品種或少量幾個(gè)品種[14-17],本實(shí)驗(yàn)對(duì)25種中國(guó)南瓜和日本南瓜品種石油醚、乙酸乙酯、甲醇提取物抗氧化能力進(jìn)行綜合考察,具有品種廣泛性和代表性,以期為南瓜抗氧化活性研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南瓜 為河南科技學(xué)院南瓜實(shí)驗(yàn)基地種植的25個(gè)南瓜品種及組合,包括中國(guó)南瓜(CucurbitamoschtaDuch.)和印度南瓜(CucurbitamaximaDuch.),詳見表1。2013年3月30日浸種催芽,4月3日播種育苗,4月15日定植。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),每個(gè)品種設(shè)3次重復(fù),共15個(gè)小區(qū),每個(gè)小區(qū)種3畦,每畦種植2行。采樣時(shí)從每個(gè)小區(qū)中選取3個(gè)成熟度一致具有該品種代表性狀的果實(shí),在生育期采用常規(guī)的栽培管理措施,于2013年7～8月間取材,并經(jīng)過(guò)后熟和貯藏,在9～10月份進(jìn)行測(cè)定分析。

二苯代苦味?；杂苫?DPPH) 東京化成工業(yè)株式會(huì)社;ABTS 德國(guó)Fluka公司;6-三吡啶基三嗪(TPTZ)及二丁基羥基甲苯(BHT) 均購(gòu)自比利時(shí)Across Organics公司;Trolox(6-hydroloxy-2,5,7,8-tetram-ethylchroman-2-carboxylicaci) 美國(guó)Sigma-Aldrich公司;其余試劑均為分析純。

Multiskan MK3型酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Electron公司;電子天平 美國(guó)Mettler-Toledo公司;N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化器械株式會(huì)社。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取物樣品的制備 南瓜果實(shí)洗凈去瓤去籽,陰干粉碎后依次用石油醚、乙酸乙酯和甲醇依次加熱提取各兩次,溫度以溶液微沸為宜,每次1h,過(guò)濾合并濾液,真空濃縮后分別得到石油醚提取物(PE)、乙酸乙酯提取物(EA)、甲醇提取物(ME)三個(gè)部位提取物。

1.2.2 提取物體外抗氧化活性篩選方法

1.2.2.1 清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基法 各提取物用甲醇溶液溶解,配制2.0mg/mL的樣品溶液,并參照文獻(xiàn)[18]的方法配制200μmol/L的DPPH溶液。在96微孔板中加入10μL樣品溶液和175μL DPPH溶液,混合均勻,室溫條件下暗反應(yīng)20min后于515nm下測(cè)定其吸光值。每份樣品平行測(cè)定3次,求均值并按照下式計(jì)算樣品清除率。樣品溶液對(duì)DPPH自由基清除率高于50%的樣品依次往下稀釋四個(gè)濃度,并依次計(jì)算清除率。

清除率(%)=[(A對(duì)照-A樣品)/A對(duì)照]×100

式中,A對(duì)照為DPPH本身在測(cè)定波長(zhǎng)處的A值;A樣品為樣品溶液對(duì)DPPH自由基作用后的A值(除去樣品自身吸收)。

計(jì)算得到的清除率,運(yùn)用Origin7.5軟件處理,得到樣品清除DPPH自由基的半數(shù)清除濃度(IC50)。

1.2.2.2 清除[2,2′-聯(lián)氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二氨鹽](ABTS)自由基法 參照[19]方法配制ABTS工作液,96微孔板中加入10μL樣品溶液和200μL工作液,混合均勻,室溫下暗反應(yīng)20min,在405nm處測(cè)定吸光值,10μL甲醇為對(duì)照。每份樣品平行重復(fù)3次,計(jì)算均值。樣品清除率按下式計(jì)算。初篩活性高于50%樣品依次往下稀釋四個(gè)濃度,并依次計(jì)算清除率。

清除率(%)=[(A對(duì)照-A樣品)/A對(duì)照]×100

式中,A對(duì)照為ABTS本身在測(cè)定波長(zhǎng)處的A值;A樣品為樣品溶液對(duì)ABTS自由基作用后的A值(除去樣品自身吸收)。

根據(jù)計(jì)算得到的清除率,運(yùn)用Origin 7.5軟件處理,計(jì)算樣品清除ABTS自由基的半數(shù)清除濃度(IC50)。

1.2.2.3 鐵離子還原法/抗氧化總能力測(cè)定法(FRAP法) 參照文獻(xiàn)[20]的方法配制TPTZ工作液:0.3mol/L醋酸鈉緩沖液、10mmol/L TPTZ溶液、20mmol/L FeCl3·6H2O三者體積比為10∶1∶1。首先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,在96孔板中加入10μLTrolx溶液和200μLFRAP工作液,混合均勻,37℃條件下反應(yīng)30min后在593nm處測(cè)定吸光度,分別以標(biāo)準(zhǔn)品Trolx濃度和吸光值為橫縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

測(cè)定樣品時(shí)在96孔板中加入10μL樣品溶液和配制好的200μL FRAP工作液,每份樣品重復(fù)3次,計(jì)算均值,結(jié)果以抗氧化當(dāng)量(即每克樣品的自由基清除能力相當(dāng)于Trolox的自由基清除能力的微摩爾數(shù)TEAC)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力

南瓜不同溶劑提取物在初篩濃度為108.11μg/mL時(shí),對(duì)DPPH自由基的清除率均小于50%。與陽(yáng)性對(duì)照BHT(濃度為54.05μg/mL時(shí)清除率為60.12%)相比,各南瓜品種的提取物清除DPPH自由基的能力均較低。證明南瓜各部位提取物并無(wú)清除DPPH自由基的能力。(因?yàn)楦鳂悠穼?duì)DPPH自由基清除率均小于50%,無(wú)法計(jì)算其IC50,對(duì)DPPH自由基清除能力較弱,因此不再列表顯示。)

2.2 樣品對(duì)ABTS自由基的清除能力

南瓜提取物在初篩濃度95.24μg/mL時(shí),多個(gè)南瓜品種乙酸乙酯部位提取物對(duì)ABTS自由基均有清除能力,表2列出了清除能力較好的幾個(gè)南瓜品種及部位和對(duì)應(yīng)清除率。南瓜提取物中有清除ABTS自由基能力較好的大部分為乙酸乙酯提取部位,其中汕美2號(hào)南瓜EA(IC50=(4.41±0.23)μg/mL)、浙江七葉南瓜EA(IC50=(5.36±0.85)μg/mL)、改良蜜本南瓜EA(IC50=(7.78±0.61)μg/mL)抗氧化能力較好,且強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照BHT(IC50=(8.59±0.56)μg/mL)。

圖1列舉了清除ABTS自由基能力較好的7個(gè)品種。由圖1可看出,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),隨著濃度升高,南瓜提取物對(duì)ABTS自由基清除率也逐漸升高。在濃度小于23.81μg/mL時(shí),乙酸乙酯部位提取物對(duì)ABTS自由基清除率增長(zhǎng)較快,超出這個(gè)范圍后,隨濃度升高,對(duì)ABTS自由基的清除率升高速度漸緩,至濃度大于47.62μg/mL后,隨濃度升高,樣品對(duì)ABTS自由基清除率不再變化,趨于穩(wěn)定。

圖1 不同品種南瓜提取物對(duì)ABTS自由基清除能力Fig.1 The extracts of different varieties pumpkins’ capacity in clear ABTS free radical ability

2.3 鐵離子還原能力/總抗氧化能力

表2列出了各提取物中鐵離子還原能力較高的幾個(gè)樣品及部位和對(duì)應(yīng)的抗氧化當(dāng)量值。由表可看出,南瓜提取物的Fe3+還原能力大小依次為:改良蜜本南瓜EA>汕美2號(hào)南瓜 EA>早熟京紅栗EA>百蜜2號(hào)EA>榛盆南瓜EA>九江轎頂南EA>靖邊南瓜EA,但它們的抗氧化能力都遠(yuǎn)小于陽(yáng)性對(duì)照Trolox(TEAC=(1387.51±137.93)μmol/g)。其中改良蜜本(TEAC=(529.65±69.52)μmol/g)、汕美2號(hào)(TEAC=(415.26±8.38)μmol/g)和早熟京紅栗(TEAC=(401.03±27.36)μmol/g)3個(gè)南瓜品種提取物的總抗氧化能力在25個(gè)南瓜品種中最高。

表2 不同品種南瓜提取物清除ABTS自由基的能力和TEAC值

3 結(jié)論與討論

目前測(cè)定體外抗氧化活性的方法較多,但大多是針對(duì)某一種自由基的清除活性,某一個(gè)方法的結(jié)果通常只代表樣品對(duì)某個(gè)自由基的清除能力。本實(shí)驗(yàn)采用三種方法來(lái)衡量樣品的抗氧化活性。

DPPH在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基,在517nm附近有較強(qiáng)的吸收,當(dāng)自由基清除劑加入到DPPH溶液中時(shí),DPPH的單電子被配對(duì),在最大吸收波長(zhǎng)處吸收顏色變淺,吸光值也有改變。ABTS是一種水溶性的自由基引發(fā)劑,經(jīng)活性氧氧化后生成一種穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽(yáng)離子自由基,若待測(cè)物中含有抗氧化物,則會(huì)與ABTS自由基發(fā)生發(fā)應(yīng)而使反應(yīng)體系顏色褪去。由Bnezie和Starni建立的FRAP法主要衡量樣品對(duì)Fe3+的還原能力,它反映的不是針對(duì)一種自由基的清除活性,而是樣品總的還原能力,DPPH和ABTS法均可通過(guò)在特定波長(zhǎng)下吸光度的變化來(lái)評(píng)價(jià)自由基的清除情況,從而評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)樣品的抗氧化能力,抗氧化能力用清除率表示,清除率越大,抗氧化性越大,FRAP法測(cè)定結(jié)果抗氧化當(dāng)量值可用于反映樣品總的抗氧化活性。

由結(jié)果看出,不同栽培品種南瓜的抗氧化活性不同,不同溶劑提取物之間的抗氧化性也有很大區(qū)別,本文采用的3種方法中,南瓜的3種不同溶劑提取物對(duì)DPPH自由基的抑制率力均較低,證明南瓜提取物還原DPPH自由基能力較差;ABTS法和FRAP法中,南瓜提取物初篩清除率大50%的樣品大部分都是乙酸乙酯(EA)部位提取物,證明南瓜的中等偏低極性成分對(duì)ABTS自由基有較好的清除能力,且總還原能力較強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)選取了的25種南瓜品種,主要包括了22種中國(guó)南瓜地方品種和3種日本南瓜,具有一定的廣泛性和代表性,其中改良蜜本南瓜、汕美2號(hào)南瓜提取物清除ABTS自由基能力和Fe3+還原能力高于其他品種,可結(jié)合其來(lái)源和品種進(jìn)一步加以深入研究。

[1]楊鵬鳴,李新崢,李孝偉,等.南瓜礦質(zhì)元素與其他品質(zhì)性狀的相關(guān)分析[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,28(2):279-281.

[2]國(guó)家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會(huì).中華本草[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1999:4597.

[3]李昌勤,盧引,顧雪竹,等. 6種栽培品種南瓜提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究[J].食品工業(yè)科技,2012,33(21):93-95.

[4]李昌勤,盧引，李新崢,等.兩種栽培品種南瓜降血糖作用的研究[J].食品工業(yè)科技,2013,34(19):328-332.

[5]Mohamed Maknia,Hamadi Fetoui,Nabil K Gargouri,et al. Antidiabetic effect of flax and pumpkin seed mixture powder:effect on hyperlipidemia and antioxidant status in alloxan diabetic rats[J]. Journal of Diabetes and Its Complication,2011,25:339-345.

[6]劉穎,金宏,許志勤,等.南瓜多糖對(duì)糖尿病大鼠血糖和血脂的影響[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志,2006(22):358-361.

[7]CailiF,HaijunT,Tongyi C,et al. Some properties of an acidic protein-bound polysaccharide from the fruit of pumpkin[J]. Food Chemistry,2007,100:944-947.

[8]李昌勤,盧引,尹震花,等.6種南瓜栽培品種體外抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技,2012(15):90-92.

[9]徐國(guó)華,韓志紅.南瓜多糖的抑瘤作用及對(duì)紅細(xì)胞免疫功能的影響[J].武漢市職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2000,28(4):8-11.

[10]Sun Y X,Liu J C. Purification,structure and immunobiological activity of a water-soluble polysaccharide from the fruiting body ofPleurotusostreatus[J]. Bioresource Technology,2009,100:983-986.

[11]王鵬,王春玲,張占偉.南瓜鎮(zhèn)痛抗炎藥理作用實(shí)驗(yàn)研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,1999,10(8):567.

[12]熊建華,閔嗣璠,董開發(fā),等.南瓜不同部位抗氧化活性的比較[J].食品研究與開發(fā),2011,32(11):135-138.

[13]李瀟霞.南瓜提取物體外抗氧化作用研究[D].西安:陜西師范大學(xué),2008.

[14]孫婕.南瓜多糖提取分離純化及其抗氧化活性的研究進(jìn)展[J].河南城建學(xué)院學(xué)報(bào),2010,19(5):43-46.

[15]李俊麗,向長(zhǎng)萍.南瓜水溶性多糖提取及抗氧化性能的研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,45(5):611-614.

[16]柳紅,張靜.不同南瓜多糖體外清除羥基自由基作用的研究[J].武漢植物學(xué)研究,2007,25(4):356-359.

[17]張靖媛,吳昊,王鳳舞,等.南瓜酒抗氧化活性及其與VC、多酚和多糖含量的關(guān)系[J].食品科學(xué),2013,34(1):78-81.

[18]于海平,孔祥密,施余杰,等.荊條花不同提取物抗氧化活性的比較研究[J].中國(guó)藥房,2013,24(39):3672-3674.

[19]Kang WY,Li CF,Liu YX. Antioxidant phenolic compounds and flavonoids of Mitragyna rotundifolia(Roxb.)Kuntzeinvitro[J]. Med Chem Res,2010,19:1222-1232.

[20]Kang WY,Wang JM.Invitroantioxidant properties andinvivolowering blood lipid of Forsythia suspense leaves[J].Med Chem Res,2010,19:617-628.

Antioxidant activity of different solvent extracts from 25 kinds of cultivatedCucurbitaLinn. fruitsinvitro

WANG Shi-miao1,KANG Wen-yi2,SUN Li1,ZHOU Jun-guo1,LI Xin-zheng1,*

(1.School of Horticulture and Landscape Architecture,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China;2. School of Pharmacy,Henan University College,Kaifeng 475000,China)

This study was aimed to evaluate the antioxidant activity of 25 kinds of pumpkin extractioninvitro. The scavenging of 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)radicals and(2,2′-even the ammonia(3-ethyl benzene and thiazole-6-sulfonic acid)diamonium salt)(ABTS)radicals assay and ferric reducing capacity(FRAP)assay were used to measure the antioxidant activity of pumpkins. And BHT was used as the positive control drug. Results showed that the scavenging capability of DPPH free radical ability was weak. The ethyl acetate extract of Shanmei II showed the strongest power to clear ABTS radical(IC50=(4.41±0.23)μg/mL),better than that of BHT(IC50=(8.59±0.56)μg/mL). The power of ethyl acetate for reduction of Fe3+ability was higher than that of other extracts,and Gailiangmiben ethyl acetate extract(TEAC=(529.65±69.52)μmol/g)was weaker than that of Trolox(TEAC=(1387.51±37.93)μmol/g).

pumpkin fruit;antioxidantinvitro;DPPH;ABTS;FRAP

2014-05-19

王士苗(1989-),女,在讀碩士生,研究方向:蔬菜種質(zhì)資源研究與利用。

*通訊作者:李新崢(1965-),男,學(xué)士，教授,主要從事南瓜資源特性與開發(fā)利用研究。

河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃(2012IRTSTHN016)。

TS255.1

A

1002-0306(2015)07-0118-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.016