威蘭膠中性蛋白酶法脫蛋白的研究

鄧 寬,李 娜,邵 闖,段 能,章望重,趙 萌

(湖北工業(yè)大學輕工學部食品與制藥工程學院,湖北武漢 430068)

威蘭膠中性蛋白酶法脫蛋白的研究

鄧 寬,李 娜,邵 闖,段 能,章望重,趙 萌*

(湖北工業(yè)大學輕工學部食品與制藥工程學院,湖北武漢 430068)

研究中性蛋白酶法制備低蛋白威蘭膠的最佳工藝及對威蘭膠樣品性質的影響。本實驗通過單因素實驗和正交優(yōu)化實驗,確定了中性蛋白酶對威蘭膠樣品的最優(yōu)除蛋白工藝。結果表明,當威蘭膠濃度1%、溫度50℃、pH6.5、酶底比1mL/g時,水解威蘭膠樣品6h獲得65.3%的最高威蘭膠蛋白質去除率;另外,比較了酶處理前后威蘭膠樣品的各組分含量和表觀粘度,結果發(fā)現(xiàn),中性蛋白酶降低了威蘭膠樣品中的蛋白質含量、提高了多糖含量,并保持了威蘭膠的高粘度特性。因而,中性蛋白酶法是制備低蛋白、高品質威蘭膠產品的有效方法。

威蘭膠,脫蛋白,中性蛋白酶

威蘭膠(welan gum),是產堿桿菌(Alcaligenes)發(fā)酵生產的一種胞外多糖[1-3],與結冷膠(gellan)、鼠李膠(rhamsan)、迪倫膠(diutan)共同構成結冷膠家族(sphingans)[4]。其結構骨架與結冷膠相同,為D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖組成的四糖片段,葡萄糖殘基的C3位連有側鏈(α-L-鼠李糖或α-L-甘露糖)[1]。威蘭膠是一種性質優(yōu)良的假塑性流體,擁有耐高溫、耐酸堿、耐鹽等優(yōu)良特性[5-6],目前主要用于油墨[1]、混凝土[7]、石油[8]等工業(yè)生產中。1996年,日本厚生省首次將威蘭膠列入食品添加劑名單(No.120,April 16,1996),其在果汁、飲料、乳制品、果醬、烘焙食品、肉制品等食品中具有應用價值。但目前商品化威蘭膠中殘留了大量蛋白質和菌體[9],這是由于威蘭膠粘度高,生產過程中無法通過離心、過濾等物理方式除菌。若要將威蘭膠產品應用于食品中,必須將其進行脫蛋白處理,獲得低蛋白威蘭膠產品。

酶法脫除粘性多糖中的蛋白,不需添加高鹽或有機溶劑,操作簡單、易于放大、綠色環(huán)保,是純化制備微生物胞外多糖的重要發(fā)展趨勢[10]。Wang等人采用堿性蛋白酶降解結冷膠中的蛋白,其蛋白質降解率高達86%[11];歐文等人比較Sevage法、三氯乙酸法、木瓜蛋白酶法對薺菜多糖除蛋白的效果,結果表明,木瓜蛋白酶法除蛋白效果最佳[12]。目前,少量文獻報道了威蘭膠的菌種選育、發(fā)酵優(yōu)化等方面的研究[13-17],但威蘭膠脫蛋白研究未曾報道。本文嘗試采用中性蛋白酶降解威蘭膠中的蛋白質,同時不改變威蘭膠高粘度特性,獲得低蛋白、高品質威蘭膠產品。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

威蘭膠 河北鑫合生物化工有限公司;中性蛋白酶 諾維信公司,20000 U/mL;乙醇、福林酚試劑、苯酚、硫酸銅、硫酸、碳酸鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉等試劑,均為分析純 購自國藥集團化學試劑有限公司。

DTU-1900紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;F-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司;旋轉流變儀Haake Rheostress 6000 美國Thermo Fisher Scientific公司;GZX-9146 MBE數(shù)顯真空干燥箱 上海博迅實業(yè)公司醫(yī)療設備廠;SRT-202滾軸式混合器 海門市其林貝爾儀器制造公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脫蛋白工藝 以20mmol/L磷酸鹽緩沖溶液配制威蘭膠溶液,加中性蛋白酶,恒溫水浴鍋反應6h,加入4倍乙醇靜置過夜,抽濾,真空干燥。將酶處理后的威蘭膠樣品溶脹,測定樣品中蛋白質含量及多糖含量,計算蛋白質去除率及多糖回收率。在實驗優(yōu)化過程中,首先采用單一因子變量法,控制其它反應條件不變,改變反應溫度(40、45、50、55、60℃)、pH(6、6.5、7、7.5、8)、酶底比(0.5、1.0、1.5、2、2.5mL/g)、威蘭膠濃度(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%),研究各反應條件對脫蛋白效果的影響。接著,采用正交實驗法(如表1所示),進行進一步優(yōu)化。

表1 正交實驗因素水平表

1.2.2 蛋白質含量測定 以牛血清蛋白為標樣,Folin-酚法[18]測定威蘭膠中蛋白含量(500nm),計算蛋白質去除率。蛋白去除率(%)=(蛋白質去除前含量-蛋白去除后含量)/蛋白質去除前含量×100。

1.2.3 多糖含量測定 以葡萄糖為標樣,硫酸苯酚法[19]測定威蘭膠中多糖含量。

1.2.4 威蘭膠樣品粘度的測定 配制一定濃度的威蘭膠溶液,置于滾軸混合器上,速度適中混合12h。在HaakeRheoStress 6000旋轉流變儀上測定威蘭膠溶液粘度,使用P60 TiL轉子,測量間距設為1mm,實驗溫度為25℃。穩(wěn)態(tài)剪切模式測定威蘭膠粘度,剪切速率設定為0.01～500s-1,對數(shù)模式采集數(shù)據(jù)點。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

運用SPSS17.0軟件進行正交設計,所有實驗均重復3次并平行取樣。數(shù)據(jù)分析均采用SPSS17.0進行處理。

2 結果與討論

2.1 中性蛋白酶制備低蛋白威蘭膠的條件優(yōu)化

2.1.1 溫度 酶的催化作用受溫度影響很大。與化學反應一樣,提高溫度可以增加酶促反應速度,但大多數(shù)酶是一種蛋白質,溫度過高會引起蛋白質變性,導致酶的失活。固定威蘭膠濃度1%、pH7、酶底比為1mL/g,分別測定40、45、50、55、60℃時的蛋白質降解率。由圖1可知:溫度對蛋白質去除率影響巨大,當溫度為50℃時,威蘭膠樣品的蛋白質去除率最高為63.7%,高于這個溫度后威蘭膠蛋白質去除率急劇下降。因而,中性蛋白酶除威蘭膠蛋白的最適反應溫度是50℃,在諾維信公司提供的中性蛋白酶最適反應溫度區(qū)間內。

圖1 溫度對中性蛋白酶除威蘭膠蛋白的影響Fig.1 The effect of temperature on deproteinization of welan gum with neutral protease

2.1.2 反應pH pH是影響酶催化效率的另一重要因素。酶只有在一定的pH范圍內才表現(xiàn)活性,活性最高時的pH稱為該酶的最適pH。當威蘭膠濃度為1%、反應溫度50℃、酶底比1mL/g時,采用不同pH(6、6.5、7、7.5、8)的20mmol/L磷酸鹽緩沖溶液配制威蘭膠溶液,考察pH對中性蛋白酶除蛋白的影響。由圖2可知:蛋白質降解率在pH6～8范圍內呈現(xiàn)先升高后減小的趨勢,其中在pH=7時蛋白質去除率最高,達62.3%。

圖2 pH對中性蛋白酶除威蘭膠蛋白的影響Fig.2 The effect of pH on deproteinization of welan gum with neutral protease

2.1.3 酶底比 固定威蘭膠濃度1%、反應溫度50℃、pH7,分別測定酶底比為0.5、1.0、1.5、2、2.5mL/g時的威蘭膠蛋白去除率,結果如圖3所示,當酶底比增加到1.0mL/g時,蛋白質去除率增加至最高,繼續(xù)增加酶底比,威蘭膠蛋白質去除率基本保持平穩(wěn),故選擇酶底比1.0mL/g,此時蛋白質去除率為57.2%。

圖3 酶底比對中性蛋白酶除威蘭膠蛋白的影響Fig.3 The effect of enzyme/substrate dosage on deproteinization of welan gum with neutral protease

2.1.4 威蘭膠濃度 固定反應溫度50℃、pH7、酶底比1mL/g,分別測定不同威蘭膠濃度(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)下的蛋白質去除率。如圖4所示,隨著威蘭膠濃度的增加,蛋白質去除率急劇下降。這可能是威蘭膠的高粘度特性造成的結果,濃度增加使得溶液粘度急劇增加,酶的流動性和催化行為大大受到限制。考慮到威蘭膠產品發(fā)酵產量在10～20g/L[13-17],發(fā)酵液稀釋造成后續(xù)威蘭膠沉淀所需酒精用量增加,故選擇威蘭膠濃度1%作為最終底物濃度,此濃度下酒精使用成本較低,蛋白去除率較高。

圖4 威蘭膠濃度比對中性蛋白酶除威蘭膠蛋白的影響Fig.4 The effect of substrate concentration on deproteinization of welan gum with neutral protease

2.2 正交實驗及實驗驗證

在單因素考察的基礎上,固定威蘭膠濃度1%,選取溫度(A)、pH(B)、酶底比(C)為考察因素,每個因素考察3個水平,進行正交實驗,以蛋白去除率優(yōu)選中性蛋白酶法除威蘭膠蛋白的工藝,實驗結果見表2。由直觀分析結果可以看出3個因素對蛋白質去除率的影響程度不同,依次為酶底比>pH>溫度,最佳條件為A2B1C1,即溫度50℃、pH6.5、酶底比1mL/g,反應6h后蛋白去除率為56.3%。

在正交實驗的最佳工藝下,即溫度50℃、pH6.5、酶底比1mL/g時,進行3次驗證實驗。測得蛋白去除率分別為62.1%、66.5%、67.2%,平均值為65.3%,3次蛋白去除率都較高,說明該正交優(yōu)化結果較好。

2.3 酶處理前后威蘭膠樣品性質比較

2.3.1 樣品中各組分含量 如表4所示,分別測量了酶處理前后威蘭膠樣品的水分、蛋白質、多糖含量。經(jīng)酶處理后,威蘭膠中蛋白質含量從20.8%下降到9.7%,多糖含量由70.5%升高至80.9%。威蘭膠樣品中蛋白質去除率達53.6%,略低于正交實驗優(yōu)化結果,這可能與樣品制備量較多,樣品粘度較高,造成酶解反應不夠充分,但酶解過程仍去除了高粘度威蘭膠樣品中的多半蛋白質。

表2 中性蛋白酶酶法除威蘭膠蛋白工藝L9正交實驗及結果

表3 正交實驗方差分析

表4 酶處理前后威蘭膠樣品中的水分、蛋白質及多糖含量

2.3.2 表觀粘度 超高粘度是威蘭膠最突出的特性,因而酶法除蛋白應確保酶處理后威蘭膠能保持這一優(yōu)良特性。如圖5所示,酶處理后,0.1%、1%威蘭膠表觀粘度值基本沒有改變。同時,酶處理前后樣品均表現(xiàn)出“剪切變稀”的假塑性流體特性。

圖5 酶處理前后威蘭膠樣品表觀粘度比較Fig.5 Viscosity comparison of welan gum before and after enzymatic treatment

3 結論

對商品化的威蘭膠進行了中性蛋白酶除蛋白研究。通過單因素實驗和正交優(yōu)化實驗,確定其最優(yōu)除蛋白工藝為:威蘭膠濃度1%、溫度50℃、pH6.5、酶底比1mL/g。最后,制備了低蛋白威蘭膠樣品,其中,蛋白質含量從初始20.8%下降到9.7%,多糖含量由70.5%升高至80.9%,同時該樣品保持了初始威蘭膠樣品的高粘度特性。

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Study on deproteinization of welan gum with neutral protease

DENG Kuan,LI Na,SHAO Chuang,DUAN Neng,ZHANG Wang-zhong,ZHAO Meng*

(School of Food and Pharmaceutical Engineering,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

The deproteinization condition of neutral protease for welan gum and the effect of hydrolysis on welan gum properties were investigated. The conditions for neutral protease to hydrolyze protein in welan gum sample were optimized through the single factor and the orthogonal experiments. The optimal welan concentration,reaction temperature,pH and enzyme/substrate dosage of deproteinization were 1%,50℃,pH6.5 and 1mL/g,respectively. After hydrolysis for 6h under these optimal conditions,the deproteinization ratio was about 65.3%. The main component contents and apparent viscosity of welan gum samples were compared before and after the enzymatic treatment. Results showed that neutral protease reduced the protein content and increased the polysaccharide content,on the premise of maintaining the high-viscosity characteristic of welan gum. Deproteinization with neutral protease is an effective method to prepare welan gum sample with low protein and good properties.

welan gum;deproteinization;neutral protease

2014-05-04

鄧寬(1991-)，女，學士，研究方向：食品功能因子的保護和增益。

湖北省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201310500020)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)07-0093-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.010

*通訊作者:趙萌(1983-)，博士，講師，研究方向：食品功能因子的保擴和增益。