實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測結(jié)核分枝桿菌在結(jié)核性胸膜炎診斷中的價(jià)值

宋予娟 王華 李愛新 耿嵐 吳園園 韓玉芳

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測結(jié)核分枝桿菌在結(jié)核性胸膜炎診斷中的價(jià)值

宋予娟 王華 李愛新 耿嵐 吳園園 韓玉芳

目的 探討實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測結(jié)核分枝桿菌在結(jié)核性胸膜炎診斷中的價(jià)值。方法 對(duì)362例臨床確診的結(jié)核性胸膜炎患者、可疑結(jié)核性胸膜炎患者和非結(jié)核性胸膜炎患者的胸水標(biāo)本采用涂片、實(shí)時(shí)熒光定量PCR兩種方法進(jìn)行檢測, 對(duì)其結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果 362例胸水標(biāo)本中, 涂片陽性率為4.42%(16/362), PCR檢測陽性率為24.31%(88/362)。胸水涂片、PCR檢測102例臨床確診的結(jié)核性胸膜炎患者胸水標(biāo)本陽性率分別為11.76%(12/102)和50.98(52/102)；檢測160例臨床可疑結(jié)核性胸膜炎患者胸水陽性率分別為2.50%(4/160)和22.50%(36/160)。兩種方法的陽性檢測率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.654, P＜0.05)。100例非結(jié)核性胸膜炎患者胸水標(biāo)本涂片及PCR檢測均為陰性。結(jié)論 熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)快速診斷結(jié)核性胸膜炎與涂片法相比較具有快速、靈敏、高特異性等優(yōu)點(diǎn)。

結(jié)核分枝桿菌；胸水涂片；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)；結(jié)核性胸膜炎

結(jié)核分枝桿菌(mucobacterium tuberculosos, MTB)是兼性的細(xì)胞內(nèi)致病菌, 它能夠?qū)е逻M(jìn)行性疾病和無癥狀的潛伏感染, 其中潛伏感染占世界人口的1/3, 并且每年有900萬新增結(jié)核病例, 200萬人死于結(jié)核?。?］。本次采用熒光定量PCR技術(shù)檢測臨床標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌并與涂片抗酸染色兩種方法, 對(duì)胸水標(biāo)本進(jìn)行檢測, 以評(píng)價(jià)FQ-PCR檢測結(jié)核分枝桿菌在結(jié)核性胸膜炎診斷中的應(yīng)用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

定量PCR方法取胸水約15 ml離心處理后如含少量細(xì)胞用雙蒸餾水洗滌沉淀2次, 采用DNA提取試劑盒提取胸水DNA,根據(jù)深圳凱杰公司熒光定量PCR擴(kuò)增試劑盒說明書操作。涂片抗酸染色：按照中國結(jié)核病防治規(guī)劃《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》中要求進(jìn)行操作［3］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.1 一般資料 2011年1月～2014年3月本院住院和門診胸部影像學(xué)診斷為胸腔積液的患者362例。其中臨床確診：102例結(jié)核性胸膜炎, 160例可疑結(jié)核性胸膜炎, 100例非結(jié)核性胸膜炎(其中肺癌12例, 其他呼吸系統(tǒng)疾病患者88例)全部患者根據(jù)X線、細(xì)菌學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)等檢查進(jìn)行了確診。

1.2 試劑與儀器 抗酸染色試劑為珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn), 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑為深圳凱杰公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒。儀器采用上海宏石SLAN實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀。

1.3 方法 患者經(jīng)胸腔穿刺及胸膜活檢, 送檢胸腔積液查常規(guī)、生化、病理學(xué)、涂片抗酸染色及結(jié)核桿菌培養(yǎng)。熒光

2 結(jié)果

362例胸水標(biāo)本中, 涂片陽性率為4.42%(16/362), PCR檢測陽性率為24.31%(88/362)。102例結(jié)核性胸膜炎患者胸水標(biāo)本涂片和FQ-PCR檢測結(jié)果：兩種方法檢測陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.021, P＜0.05)。160例可疑結(jié)核性胸膜炎患者胸水涂片和FQ-PCR檢測結(jié)果, 兩種方法檢測陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.654, P＜0.05)。對(duì)于臨床確診和可疑結(jié)核性胸膜炎患者的胸水標(biāo)本FQ-PCR陽性率分別是涂片的4.33(50.98%/11.76%)倍和9.00(22.50%/2.50%)倍。100例非結(jié)核性胸膜炎患者胸水標(biāo)本涂片和FQ-PCR檢測結(jié)果均為陰性。見表1, 表2。

表1 102例結(jié)核性胸膜炎患者胸水標(biāo)本涂片和FQ-PCR檢測結(jié)果比較(n, %)

表2 160例可疑結(jié)核性胸膜炎患者胸水標(biāo)本涂片和FQ-PCR檢測結(jié)果(n, %)

3 討論

結(jié)核病目前的主要途徑和手段還是以細(xì)菌學(xué)檢查為主,如涂片鏡檢分離培養(yǎng)菌型鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)等。實(shí)時(shí)FQ-PCR技術(shù)自1996年問世以來短短幾年就以其獨(dú)特的優(yōu)勢在生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究方面發(fā)揮巨大的作用, 本研究建立的FQ-PCR特異性、敏感性、質(zhì)量性均較好。對(duì)102例確診結(jié)核性胸膜炎, 160例可疑結(jié)核性胸膜炎, 100例非結(jié)核性胸膜炎患者的胸水標(biāo)本進(jìn)行結(jié)合分型桿菌檢測, 結(jié)果顯示涂片和實(shí)時(shí)熒光定量檢測陽性率分別為11.76%、50.98%、2.50%、22.50%和0、0, 說明熒光PCR技術(shù)可有效檢測標(biāo)本中特異基因片段, 而涂片鏡檢無法檢測。FQ-PCR陽性率,較涂片法顯著增高, 且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其原因可能有當(dāng)標(biāo)本中MTB濃度＞10 ml時(shí)涂片染色法才可檢出, MTB在標(biāo)本中少聚集成團(tuán)導(dǎo)致圖片分布不勻［3］, 染色過程中沖洗操作很有可能導(dǎo)致載玻片上的MTB流失。本研究102例確診的結(jié)核性胸膜炎患者中50例FQ-PCR檢測為陰性,可能是擴(kuò)增中存在DNA聚合酶的抑制物或者患者此時(shí)不排菌, 需要對(duì)患者進(jìn)行間斷性FQ-PCR定量動(dòng)態(tài)觀察。另在160例可疑結(jié)核性胸膜炎患者胸水中檢測到36例陽性, DNA測序分析確診為陽性, 說明其具有很高的敏感性［2］。

綜上所述, FQ-PCR對(duì)于結(jié)核性胸膜炎具有較高的診斷、治療價(jià)值。其敏感、特異、污染少的可動(dòng)態(tài)定量方法有利于臨床患者的動(dòng)態(tài)觀察和療效觀察, 也有利于結(jié)核病的控制。

［1］ 吳睿彥, 陳志成, 肖芃, 等.結(jié)核分枝桿菌定量聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)結(jié)核性腦膜炎早期診斷價(jià)值.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 28(17): 2867-2869.

［2］ 金建東.TB-SA結(jié)核分支桿菌抗體檢測對(duì)結(jié)核性胸膜炎的診斷意義.臨床肺科雜志, 2013, 18(2):299-300.

［3］ 李銳成, 劉昕陽, 閻琳, 等.實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)在結(jié)核性腦膜炎診斷價(jià)值.臨床薈萃, 2014, 29(1):31-34.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.09.067

2014-11-19］

453000 新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科(宋予娟 王華 吳園園 韓玉芳)；新鄉(xiāng)市中心血站(李愛新)；新鄉(xiāng)市傳染病醫(yī)院(耿嵐)