均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)選仙茅多糖提取工藝的研究

杜永華，蒲忠慧，魏琴，尹禮國(guó)，張萍，徐莉，張琪

（1.宜賓學(xué)院發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓644007；2.綿陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川綿陽(yáng)621006；3.宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川宜賓644007）

多糖（polysaceharide）是一類(lèi)天然大分子化合物，存在于動(dòng)植物和微生物中，為生命物質(zhì)的組成成分之一。大量藥理及臨床研究證實(shí)，多糖有提高機(jī)體的免疫力、抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、降血糖和降血脂等生理功能[1-9]。因此，對(duì)多糖的研究已成為各國(guó)學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。

仙茅（Curculigo orchioides Gaertn）是石蒜科仙茅屬植物仙茅的干燥根莖，具有抗缺氧、抗高溫、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗炎、抗骨質(zhì)疏松、增強(qiáng)免疫功能、抗衰老[10]、促進(jìn)乳腺發(fā)育[11]、延緩生殖系統(tǒng)老化和雄激素樣[12]作用等功效，其中多糖類(lèi)化合物是仙茅根中重要的藥效成分。周勇等[13]研究表明仙茅多糖具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等作用。有關(guān)仙茅多糖提取工藝的報(bào)道極少，聶詩(shī)明等[14]采用正交試驗(yàn)以仙茅苷和仙茅多糖為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)選仙茅水煎煮工藝。本研究擬采用均勻設(shè)計(jì)法對(duì)仙茅多糖的提取工藝和含量測(cè)定進(jìn)行研究，以期為仙茅進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

仙茅根：產(chǎn)地為四川，購(gòu)自于四川宜賓正源藥業(yè)有限公司，由其鑒定為石蒜科植物仙茅（Curculigo orchioides Gaertn）的干燥根莖。

所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

中草藥粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R502B：上海亞榮生化儀器廠；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京譜析通用儀器有限公司；TCL-16C型高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 仙茅粗多糖的提取

參考季春[15]的方法提取仙茅粗多糖。將市購(gòu)仙茅粉碎，篩選出80目～100目的細(xì)粉于50℃烘箱內(nèi)烘干，取50 g，按比例加入蒸餾水回流提取，過(guò)濾，濃縮至約100 mL，再將濃縮液用Savage法除蛋白，即是向濃縮液中加其1/4體積的三氯甲烷，隨之再加入三氯甲烷體積1/4的正丁醇，劇烈振搖5 min～10 min，混勻，以1 500 r/min離心20 min，分去水層與有機(jī)層交界處的變性蛋白質(zhì)，水層仍按照此方法反復(fù)除蛋白5次：然后在上清液中加入95%乙醇調(diào)含醇量為80%，沉淀過(guò)夜。沉淀用布氏漏斗抽濾，然后用無(wú)水乙醇和丙酮反復(fù)多次抽洗，直至沉淀呈粉末狀時(shí)將其置于表面皿中。將表面皿于60℃干燥至恒重即得仙茅多糖粗品，計(jì)算粗多糖得率。

1.3.2 提取工藝優(yōu)化

采用均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)，選取對(duì)提取率影響較大的因素：提取溫度（χ1）、液固比（χ2）、浸泡時(shí)間（χ3）、提取時(shí)間（χ4），進(jìn)行U10（104），即四因素十水平均勻設(shè)計(jì)優(yōu)選提取仙茅多糖（見(jiàn)表1），每個(gè)因素10水平，以仙茅多糖得率為指標(biāo)確定最佳提取工藝。試驗(yàn)安排方法見(jiàn)表2。

表1 仙茅提取工藝均勻設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of uniform design experiments for optimizing extraction processing of Curculigo orchioides Gaertn

續(xù)表1 仙茅提取工藝均勻設(shè)計(jì)因素水平表Continue table 1 Factors and levels of uniform design experiments for optimizing extraction processing of Curculigo orchioides Gaertn

表2 仙茅提取工藝均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案Table 2 Pilot programs of uniform design experiments for optimizing extraction processing of Curculigo orchioides Gaertn

1.3.3 含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸比色法測(cè)定粗多糖中仙茅總糖含量。按照以下公式計(jì)算仙茅多糖含量：總多糖提取率/%=（粗多糖提取物總重量×粗多糖中總糖含量）/仙茅質(zhì)量×100

粗多糖得率/%=粗多糖凈重/仙茅質(zhì)量×100

1.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照仙茅苷提取的優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Uniform Design Version3.00對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行后退回歸分析，根據(jù)回歸方程的回歸系數(shù)、F值及其顯著性檢驗(yàn)，由軟件采用單指標(biāo)Ⅰ型可約束條件試驗(yàn)優(yōu)化方案選取優(yōu)化工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程如下：y=0.007 6x+0.025 6，決定系數(shù) R2=0.996 8，

式中：y為吸光度，x葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中對(duì)應(yīng)的葡萄糖質(zhì)量濃度（μg/mL）。

2.2 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

采用均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)安排的仙茅浸膏的提取結(jié)果及仙茅苷提取率結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 仙茅粗多糖的得率及總多糖的含量Table 3 Yield and total polysaccharide content of Curculigo orchioides Gaertn polysaccharides

由表3可知，在仙茅粗多糖凈重和得率方面：7號(hào)試驗(yàn)組最少，分別為8.49 g和16.98%；9號(hào)試驗(yàn)組最多，分別為10.64 g和21.28%。9號(hào)試驗(yàn)組的提取條件為提取溫度95℃，液固比30倍，浸泡時(shí)間30 min，提取時(shí)間30 min。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出各試驗(yàn)樣品中仙茅總糖含量表示：在仙茅總多糖質(zhì)量和多糖提取率方面：2號(hào)試驗(yàn)組最低，分別為1.28 g和2.56%；8號(hào)試驗(yàn)組最高，分別為2.98 g和5.97%。8號(hào)試驗(yàn)組的提取條件為提取溫度90℃，液固比15倍，浸泡時(shí)間135 min，提取時(shí)間150 min。

2.3 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析

采用Uniform Design Version 3.00對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行后退回歸分析，在顯著水平α=0.10時(shí)，第一次回歸方程為Y=2.927 9+0.042 0X1-0.040 2X2+0.000 9X3-0.006 1X4，復(fù)相關(guān)系數(shù) R=0.924 4，F(xiàn)檢驗(yàn)值（7.342）＞F臨界值（3.520），回歸方程顯著。各方程對(duì)回歸的貢獻(xiàn)值（偏回歸平方和）U1（2.843）＞U2（2.613 7）＞U4（0.963 0）＞U3（0.012 6）。將第三方程項(xiàng)X3進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，F(xiàn)檢驗(yàn)值（0.0523）＜F臨界值（4.060），方程不顯著，剔除方程項(xiàng)X3。新建回歸方程為Y=2.932 1+0.042 9X1-0.041 2X2-0.006 0X4，復(fù)相關(guān)系數(shù) R=0.923 6，F(xiàn)檢驗(yàn)值（11.60）＞F臨界值（3.289），方程顯著。再次對(duì)貢獻(xiàn)最小的方程項(xiàng)X4進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，α=0.10，F(xiàn)檢驗(yàn)值（4.717）＞F臨界值（3.776），方程顯著，不需再剔除方程項(xiàng)。新建回歸方程的顯著性檢驗(yàn)變量分析和殘差分析見(jiàn)表4和表5。

表4 變量分析Table 4 Variance analysis

表5 回歸模型殘差分析Table 5 Residual analysis of regression equation

根據(jù)新建回歸方程，采用網(wǎng)格嘗試法單指標(biāo)Ⅰ型可約束條件試驗(yàn)優(yōu)化方案，優(yōu)化試驗(yàn)條件，得到仙茅粗多糖的最佳提取工藝：提取溫度為100℃，液固比為10 ∶1（mL/g），提取時(shí)間為 30 min。在此條件下，仙茅總多糖的預(yù)期得率為（6.63±0.87）%。

2.4 均勻驗(yàn)證

稱(chēng)取80目～100目的上述仙茅粉50 g，于50℃烘箱內(nèi)烘干，以提取溫度100℃，液固比10∶1（mL/g），提取時(shí)間30 min為提取工藝，用水回流提取，過(guò)濾，濾液60℃減壓濃縮，濃縮液（約100 mL）用95%乙醇調(diào)含醇量為80%，靜置過(guò)夜，過(guò)濾取沉淀，沉淀用無(wú)水乙醇洗滌，常溫真空干燥，采用蒽酮-硫酸法測(cè)定仙茅多糖的含量。結(jié)果：粗多糖得率為21%，總多糖提取率為6.18%。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化仙茅粗多糖提取工藝的研究，結(jié)果表明提取溫度、液固比、提取時(shí)間對(duì)仙茅總多糖得率影響顯著，而浸泡時(shí)間對(duì)仙茅總多糖得率影響很小。經(jīng)過(guò)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)回歸統(tǒng)計(jì)分析優(yōu)選仙茅粗多糖的最佳提取工藝為：提取溫度為100℃，液固比為10 ∶1（mL/g），提取時(shí)間為 30 min，仙茅總多糖得率為6.18%。

[1] 唐杰.植物多糖生物活性功能的研究進(jìn)展[J].營(yíng)養(yǎng)健康,2006,27(5):130-132

[2] 牛廣財(cái),朱丹.植物多糖的生物活性及其制備技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2005,26(6):191-193

[3] 董永軍,王麗榮,胡建和,等.植物多糖生物活性的研究進(jìn)展[J].中國(guó)牧業(yè)通訊,2009(14):5-6

[4] 彭會(huì)軍,鄒群.植物多糖的生物活性研究進(jìn)展[J].西北醫(yī)學(xué)雜志,2008,23(6):406-408

[5] 汪志好.植物多糖的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和藥學(xué)研究,2006,6(2):86-88

[6] 睢大員,于曉風(fēng).枸杞子、北五味子和黃精三種粗多糖的增強(qiáng)免疫與抗脂質(zhì)氧化作川[J].白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1996,22(6):606-609

[7] 鄭晶泉.抗氧化劑抗氧化實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè),2000,27(1):37-40

[8] 王庭欣,王庭祥,龐佳宏.植物多糖生物活性研究進(jìn)展[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2005,26(6):200-202

[9] 韋巍,李雪華.多糖的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊(cè),2005,32(3):179-184

[10]黃有霖.仙茅的研究進(jìn)展[J].中藥材,2003,26(3):225-229

[11]吳瓊.中藥仙茅化學(xué)成分及其抗氧化活性研究[D].上海:復(fù)旦大學(xué),2005

[12]周勇,張麗,趙離原,等.仙茅多糖對(duì)小鼠免疫功能調(diào)節(jié)作用實(shí)驗(yàn)研究[J].上海免疫學(xué)雜志,1996,16(6):336-337

[13]羅巔輝.均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化高麗參多糖的提取[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2008,20(3):383-387

[14]聶詩(shī)明,張麗萍,盧水珍,等.正交試驗(yàn)法優(yōu)選仙茅提取工藝的研究[J].中成藥,2002(9):665-667

[15]季春.仙茅多糖COPb-1和COPf-1的分離純化及結(jié)構(gòu)研究[J].貴州化工,2005,30(1):17-19