CD8+T 細(xì)胞在大鼠慢性支氣管炎中表達(dá)及意義

劉積鋒，鐘小寧，何志義，牙蕾蕾，覃向林，張建全，陳 罡

0 引 言

慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydiseases，COPD)在機(jī)體病理上主要表現(xiàn)為慢性支氣管炎和肺氣腫，CD8+T 細(xì)胞在COPD 中增多，在其穩(wěn)定期也持續(xù)存在，與小氣道炎癥滲出有關(guān)［1-3］。近年來(lái)研究表明在神經(jīng)炎癥情況下可啟動(dòng)CD8+T細(xì)胞表達(dá)從而增加血管通透性［4-6］。研究表明，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)可減輕血管通透性和炎癥浸出［7-9］。CD8+T 細(xì)胞是否與COPD 的小氣道VEGF 表達(dá)增加及氣道炎癥損傷有關(guān)尚不清楚。N-乙酰半胱氨酸(acetylcysteine，NAC)抗氧化機(jī)制是通過(guò)下調(diào)核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)活性來(lái)減輕炎癥反應(yīng)［10-12］，NAC 是否通過(guò)抑制NF-κB 活性使CD8+T 細(xì)胞降低尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)觀察煙草煙霧暴露及脂多糖誘導(dǎo)的慢性支氣管炎大鼠的小氣道CD8+T 的表達(dá)，通過(guò)給予NAC 干預(yù)來(lái)探討小氣道CD8+T 細(xì)胞VEGF 及炎癥損傷浸出的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF 級(jí)健康雄性Wistar 大鼠，體重(230±20)g，18 只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK 桂2009-0002，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供;劉三姐烤煙型香煙(南寧卷煙廠生產(chǎn))(焦油含量:15 mg，煙堿含量:1.1 mg);自制0.22 m3玻璃箱(1.00 m×0.55 m×0.40 m);AB204-E 分析天平(瑞士梅特勒—托利多公司生產(chǎn)，廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供);YHL-1 智能測(cè)氧儀(中國(guó)航天科技集團(tuán)公司第七零三研究所生產(chǎn));奧林巴斯光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司生產(chǎn)，廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供)及Image-Pro Plus 6.0 軟件(美國(guó)Media Cybernetics 公司，廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供)。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和NAC 均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。CD8+、NF-κB、Ⅰ類主要相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex classI，MHCI)及VEGF 一抗(Santa Cruz 公司生產(chǎn)，美國(guó))，CD8+T 細(xì)胞二抗(CheIIlicon 公司，美國(guó));MHCI 二抗(Santa Cruz 公司生產(chǎn)，美國(guó))，NF-κB、VEGF 二抗、二氨基聯(lián)苯胺(均購(gòu)于福州邁新公司)。

1.2 制備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型 參照鐘小寧等［13］的方法，采用2 次氣管內(nèi)注入LPS 及煙熏4 周建立大鼠慢性支氣管并肺氣腫動(dòng)物模型。將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3 組:假吸煙組、慢性支氣管炎和NAC 組，每組6 只。3 組大鼠均以相同飼料及水喂養(yǎng)(由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。假吸煙組大鼠第1、14天經(jīng)氣道內(nèi)注入等滲鹽水0.2 mL，注入前1 d 用雙蒸餾水灌胃(1 mL/只)，第2-13 天及第15-28 天放入玻璃箱內(nèi)2 h/d(箱內(nèi)有一小孔與外界相通，內(nèi)置無(wú)水氯化鈣及鈉石灰吸收水分和CO2，氧濃度穩(wěn)定在21%)，每天放入箱前用雙蒸餾水灌胃(1 mL/只)，大鼠可在玻璃箱內(nèi)自由進(jìn)食、飲水。慢性支氣管炎組大鼠第1、14 天經(jīng)氣道內(nèi)注入LPS 200 μg(1 μg/μL)，注入LPS 溶液前1 d 用雙蒸餾水灌胃(1 mL/只)，第2-13 天及第15-28 天在與假吸煙組相同條件的玻璃箱內(nèi)煙熏2 h(每次5 支，30 min/次)，煙熏前用雙蒸餾水給大鼠灌胃(1 mL/只)。NAC 組大鼠氣道內(nèi)注入LPS 溶液前1 d 用NAC 給大鼠灌胃(200 mg/kg，用雙蒸餾水稀釋成50 mg/mL 溶液)，第2-13 天及第15-28 天煙熏前NAC 給大鼠灌胃(200 mg/kg，用雙蒸餾水稀釋成50 mg/mL 溶液)，煙熏方法與慢性支氣管炎組相同。

1.3 肺組織病理學(xué)標(biāo)本制備及切片染色 根據(jù)Givi等［14］的方法制備肺病理學(xué)標(biāo)本組織，右下葉距肺門(mén)約3 mm 處取材，連續(xù)切片行HE 染色。取左下肺用10%中性甲醛固定24 h 后石蠟包埋，在距肺門(mén)4 mm 處切片。

1.4 氣道炎癥病變的觀察指標(biāo)及評(píng)分方法 根據(jù)Cosio等［15］設(shè)計(jì)的小氣道病變?cè)u(píng)估方法加以改進(jìn)觀察(由2 名不知分組情況的病理科醫(yī)師完成)，每只大鼠選擇5 條直徑在700 ～1200 μm 的膜性細(xì)支氣管，觀察小氣道炎癥7 項(xiàng)指標(biāo)［15］并評(píng)分:無(wú)病變者為0 分，輕度、中度、重度炎癥病變分別評(píng)為1、2、3分。然后累加每一指標(biāo)得分，取平均值作為該指標(biāo)病理積分。

1.5 肺組織NF-κB、MHCI、CD8+T 細(xì)胞表達(dá)及VEGF 免疫組化評(píng)價(jià)方法 所有切片觀察參照文獻(xiàn)［15］的方法，由2 名不知分組情況的病理醫(yī)師完成。參照文獻(xiàn)［16］的方法進(jìn)行評(píng)分:陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為“-”、10%～24%為“+”、25%～75%為“2+”、＞75%為“3+”，分別計(jì)分為1、2、3、4 分;顯色強(qiáng)度分別以“+/-”、“+”、“2+”表示，分別計(jì)分為1、2、3 分，將兩者計(jì)分相乘取平均值。1 ～4 分為低表達(dá)、5 ～8分為中表達(dá)、9 ～12分為高表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料以中位數(shù)(四分位間距)表示，相關(guān)分析采用Kendall 等級(jí)相關(guān)分析，以P≤0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小氣道病理學(xué)改變 假吸煙組僅見(jiàn)少量纖毛倒伏粘連、無(wú)纖毛脫落，上皮細(xì)胞無(wú)變性壞死和糜爛脫落，無(wú)杯狀細(xì)胞增生，氣道黏膜無(wú)水腫滲出，管壁僅見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞，無(wú)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)。慢性支氣管炎組存在纖毛倒伏粘連和脫落、上皮細(xì)胞變性壞死糜爛脫落、杯狀細(xì)胞增生、氣道管壁黏膜充血水腫滲出明顯、管壁炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(包括淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞)。NAC 組小氣道纖毛倒伏粘連和脫落、上皮細(xì)胞變性壞死糜爛脫落、管壁炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均減輕。見(jiàn)圖1。假吸煙組、NAC 組病理積分(1.17±2.40、4.66±2.25)均較慢性支氣管炎組(10.83±3.31)降低(P ＜0.05)，而假吸煙組與NAC 組病理積分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

圖1 鏡下觀察大鼠氣道病理形態(tài)(HE ×400)Figure 1 The pathomorphologicalfeatureof airway in each group(HE ×400)

2.2 NF-κB、MHCI、CD8+T 細(xì)胞及VEGF 表達(dá)光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn):NF-κB 主要在氣道上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)，MHCI 主要在氣道上皮細(xì)胞表面表達(dá)，CD8+細(xì)胞在氣道上皮細(xì)胞組織中表達(dá)。VEGF 在氣道上皮細(xì)胞組織中及外周組織均有表達(dá)。慢性支氣管炎組、NAC 組的CD8+T 細(xì)胞、VEGF 表達(dá)較假吸煙組、NAC 組高(P ＜0.05)，假吸煙組與NAC組的MHCI、CD8+T 細(xì)胞、VEGF 表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見(jiàn)圖2-圖5，表1。經(jīng)Spearman's相關(guān)分析，NF-κB 與MHCI、CD8+T 細(xì)胞呈正相關(guān)(r=0.794，P=0.0046;r=0.670，P=0.002)，MHCI與CD8+T 細(xì)胞呈正相關(guān)(r=0.701，P=0.007)，CD8+T 細(xì)胞與VEGF 細(xì)胞呈正相關(guān)(r=0.782，P ＜0.01)，VEGF 在膜性支氣管壁和外周組織中的表達(dá)與小氣道炎癥積分呈正相關(guān)(r=0.689，P=0.002)。

圖2 光學(xué)顯微鏡下觀察NF-κB 在大鼠氣管的表達(dá)(SP×400)Figure 2 The expression of NF-κB in airway of each group(immunohistochemisty stained by labeled streptavidin biotin method ×400)

圖3 光學(xué)顯微鏡下觀察MHCI 在大鼠氣道腔上皮細(xì)胞的表達(dá)(SP ×400)Figure 3 The expression of MHCI in airway of each group(immunohistochemisty stained by labeled streptavidin biotin method ×400)

圖4 光學(xué)顯微鏡下觀察CD8+在大鼠氣管的表達(dá)(SP×400)Figure 4 The expression of CD8+in airway of each group(immunohistochemisty stained by labeled streptavidin biotin method ×400)

圖5 光學(xué)顯微鏡下觀察VEGF 在大鼠氣管的表達(dá)(SP×400)Figure 5 The expression of VEGF in airway of each group(immunohistochemisty stained by labeled streptavidin biotin method ×400)

表1 大鼠NF-κB、MHCI、CD8+T 細(xì)胞和VEGF 的表達(dá)比較［中位數(shù)(P25，P75)］Table 1 The expression of NF-κB，MHCI，CD8+T and VEGF in each group(M［P25，P75］)

3 討 論

本研究表明煙草煙霧暴露和LPS 誘導(dǎo)大鼠慢性支氣管炎中NF-κB、MHCI 和CD8+T 細(xì)胞主要在氣道上皮組織中表達(dá)升高，VEGF 在氣道上皮組織中和外周組織中表達(dá)均升高，同時(shí)小氣道病理積分增多;NF-κB、MHCI 與CD8+T 細(xì)胞呈正相關(guān)，CD8+T 細(xì)胞與VEGF 升高和小氣道病理積分呈正相關(guān);表明氣道上皮組織NF-κB 和MHCI 表達(dá)增強(qiáng)可能與CD8+T細(xì)胞活化浸潤(rùn)有關(guān)，CD8+T 細(xì)胞活化浸潤(rùn)與VEGF的表達(dá)和小氣道炎癥損傷浸出有關(guān)。而給予NAC預(yù)防性干預(yù)后支氣管壁上皮組織的NF-κB、MHCI 表達(dá)下調(diào)和CD8+T 細(xì)胞減少，同時(shí)VEGF 表達(dá)和小氣道病理積分下降。

上皮組織NF-κB 活化后可促進(jìn)MHCI 表達(dá)來(lái)激活CD8+T 細(xì)胞等炎癥細(xì)胞［18-20］。而近年來(lái)研究表明CD8+T 細(xì)胞在神經(jīng)炎癥情況下可啟動(dòng)VEGF 表達(dá)促進(jìn)血管通透性［4-6］，VEGF 升高可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的連接增寬引起通透性增加和炎癥細(xì)胞浸出［6-8］。本研究顯示大鼠慢性支氣管炎中上皮組織NF-κB 表達(dá)升高與CD8+T 細(xì)胞增多及與VEGF 在氣道上皮細(xì)胞中表達(dá)升高和小氣道損傷炎癥細(xì)胞浸出有關(guān)，表明大鼠支氣管上皮細(xì)胞受到煙草煙霧刺激后可能激活NF-κB 炎癥信號(hào)并將抗原通過(guò)MHCI提呈給CD8+T 細(xì)胞使其細(xì)胞活化增多，并誘導(dǎo)VEGF 在氣道上皮細(xì)胞中表達(dá)升高引起氣道炎癥浸出及損傷反應(yīng)。近年來(lái)研究顯示NAC 可通過(guò)抑制NF-κB 活性而減輕炎癥和組織損傷［10-12，21-22］。在本研究中經(jīng)NAC 預(yù)防性干預(yù)后大鼠NF-κB、MHCI表達(dá)降低和CD8+T 細(xì)胞減少，并使VEGF 在氣道上皮細(xì)胞中表達(dá)下降和減輕小氣道損傷浸出，說(shuō)明NAC 可能抑制煙草煙霧暴露和LPS 誘導(dǎo)大鼠慢性支氣管炎中NF-κB、MHCI 表達(dá)而抑制CD8+T 細(xì)胞和VEGF 活化從而減輕小氣道炎癥損傷浸出。

［1］ Vestbo J，Hurd SS，Agustí AG，et al.Global strategy for the diagnosis，management，and prevention of chronic obstructive pulmonary disease:GOLD executive summary［J］.Am J Respir Crit Care Med，2013，187(4):347-365.

［2］ L?fdahl MJ，Roos-Engstrand E，Pourazar J，et al.Increased intraepithelial T-cells in stable COPD［J］.Respir Med，2008，102(12):1812-1818.

［3］ 孔令雯，董競(jìng)成.氧化應(yīng)激致組蛋白修飾在慢性阻塞性肺病發(fā)生發(fā)展中的作用［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2014，27(9):968-972.

［4］ Suidan GL，Dickerson JW，Chen Y，et al.CD8 T cell-initiated vascular endothelial growth factor expression promotes central nervous system vascular permeability under neuroinflammatory conditions［J］.J Immunol，2010，184(2):1031-1040.

［5］ Suidan GL，Dickerson JW，Johnson HL，et al.Preserved vascular integrity and enhanced survival following neuropilin-1 inhibition in a mouse model of CD8 T cell-initiated CNS vascular permeability［J］.J Neuroinflammation，2012，18(9):218-224.

［6］ Suidan GL，Mcdole JR，Chen Y，et al.Induction of blood brain barrier tight junction protein alterations by CD8 T cells［J］.PLoS One，2008，3(8):e3037-3046.

［7］ 韓曼麗，章金春.雷公藤多苷對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2 mRNA 表達(dá)水平的影響［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2013，26(5):478-480.

［8］ Azimi-Nezhad M，Stathopoulou MG，Bonnefond A，et al.Associations of vascular endothelial growth factor(VEGF)with adhesion and inflammation molecules in a healthy population［J］.Cytokine，2013，61(2):602-607.

［9］ Park SJ，Lee KS，Kim SR，et al.AMPK activation reduces vascular permeability and airway inflammation by regulating HIF/VEGFA pathway in a murine model of toluene diisocyanate-induced asthma［J］.Inflamm Res，2012，61(10):1069-1083.

［10］ 鄒小英，何志義，鄧家珍，等.N-乙酰半胱氨酸對(duì)吸煙所致大鼠肺部炎癥的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2008，24(10):2013-2015.

［11］ 劉小龍，王常田，黃海嶸，等.白藜蘆醇減輕大鼠體外循環(huán)肺損傷的實(shí)驗(yàn)研究［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2013，26(3):244-247.

［12］ 呂秋石，郭芮兵，姜永軍，等.神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)顱腦外傷大鼠的抗炎作用機(jī)制［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2014，27(10):1020-1022.

［13］ 鐘小寧，白 晶，施煥中，等.慢性支氣管炎與肺氣腫大鼠氣道炎癥與重塑的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2003，26(12):750-755.

［14］ Givi ME，Peck MJ，Boon L，et al.The role of dendritic cells in the pathogenesis of cigarette smoke-induced emphysema in mice［J］.Eur J Pharmacol，2013，721(1-3):259-266.

［15］ Cosio M，Chezzo H，Hogg JC，et al.The relations between structural changes in small airways and pulmonary function tests［J］.N Engl J Med，1978，298(23):1277-1281.

［16］ 徐 洪，楊 方，袁 媛，等.免疫組織化學(xué)Image Pro Plus圖像半定量分析的參數(shù)選擇［J］.解剖學(xué)雜志，2012，35(1):37-41.

［17］ 劉積鋒，鐘小寧，張健全，等.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子與慢性支氣管炎并肺氣腫大鼠早期肺動(dòng)脈重塑關(guān)系的研究［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2006，29(5):353-354.

［18］ Wullaert A，Bonnet MC，Pasparakis M.NF-κB in the regulation of epithelial homeostasis and inflammation［J］.Cell Res，2011，21(1):146-158.

［19］ Sohal SS，Reid D，Soltani A，et al.Evaluation of epithelial mesenchymal transition in patients with chronic obstructive pulmonary disease［J］.Respir Res，2011，12(10):130.

［20］ Kreisel D，Lai J，Richardson SB，et al.Polarized alloantigen presentation by airway epithelial cells contributes to direct CD8+T cell activation in the airway［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2011，44(6):749-754.

［21］ Wang HW，Yang W，Lu JY，et al.N-acetylcysteine administration is associated with reduced activation of NF-κB and preserves lung dendritic cells function in a zymosan-induced generalized inflammation model［J］.J Clin Immunol，2013，33(3):649-660.

［22］ Pires KM，Lanzetti M，Rueff-Barroso CR，et al.Oxidative damage in alveolar macrophages exposed to cigarette smoke extract and participation of nitric oxide in redox balance［J］.Toxicol In Vitro，2012，26(6):791-798.