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    培美曲塞聯(lián)合β-欖香烯對宮頸癌HeLa 細(xì)胞增殖和凋亡的影響

    2015-05-07 02:57:48馬力天毛立挺任秦有邢勁松
    關(guān)鍵詞:香烯培美曲塞

    白 楊,李 錄,馬力天,張 毅,毛立挺,馬 瑞,任秦有,胡 月,邢勁松,鄭 瑾

    0 引 言

    我國每年宮頸癌新發(fā)病例占全球的28.8%[1]。目前,不少中藥用于抗腫瘤治療[2],欖香烯是從中藥溫郁金中提取出的國家二類抗腫瘤新藥[3],其中β-欖香烯具有較好的抗腫瘤作用。其抗腫瘤效果明確且不發(fā)生骨髓抑制[4]。將β-欖香烯引入到傳統(tǒng)化療方案中可能會取得更好的效果并減輕患者痛苦。本實驗使用β-欖香烯聯(lián)合培美曲塞對宮頸癌HeLa 細(xì)胞進行體外實驗,探討聯(lián)合用藥的可行性,為臨床制訂化療方案提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 藥物與試劑 β-欖香烯(大連華立金藥業(yè)有限公司),MTT(購自晶彩生物有限公司),培美曲塞二鈉(Ei Lilly and Company)、DMEM 高糖培養(yǎng)基(Thermofisher)、四季青胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)。HeLa 細(xì)胞(第四軍醫(yī)大學(xué)放射醫(yī)學(xué)教研室),流式細(xì)胞儀(美國Bection Dickinson 公司)。

    1.2 HeLa 細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代 用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素、1% L-谷氨酰胺的DMEM 培養(yǎng)基將HeLa 細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞孵箱中,每天換液1 次。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞密度為80%~90%時,以胰酶37 ℃消化2 ~3 min 傳代。

    1.3 藥物濃度的選擇 按照文獻[5]的方法選擇藥物濃度,公式如下:

    S=0.006 1H+0.012 4W-0.009 9

    S 為體表面積(m2);H 為身高(cm);W 為體重(kg)。培美曲塞的臨床推薦化療劑量為500 mg/m2,計算50 kg 患者體內(nèi)藥物濃度為82.355 μg/mL,因此我們培美曲塞的濃度梯度為38、76、152、228、304 μg/mL。

    1.4 MTT 法檢測HeLa 細(xì)胞的增殖情況 對數(shù)生長期的HeLa 細(xì)胞,以離心半徑13 cm、1000 r/min離心5 min,用高糖DMEM(含10%胎牛血清)將細(xì)胞濃度調(diào)為1×105個/mL 細(xì)胞懸液后,接種于96 孔培養(yǎng)板,加細(xì)胞懸液100 μL/孔,置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中,細(xì)胞貼壁長到60%~70%后,更換培養(yǎng)基,并且每孔分別加入培美曲塞(溶于PBS 中),使終濃度達到38、76、152、228、304 μg/mL。每個濃度設(shè)4 個復(fù)孔,另設(shè)空白對照(0 μg/mL)。單獨作用24、48 h,每孔加20 μL MTT,于37 ℃、5%CO2培育箱中孵育4 h 后取出并將含MTT 的細(xì)胞培養(yǎng)基吸出(注意不要吸掉孔底的MTT 結(jié)晶),于微量振蕩器上振蕩5 min,用酶聯(lián)免疫檢測儀處測量各孔的A490。實驗重復(fù)3 次,取均值計算增殖抑制率。公式如下:

    增殖抑制率=(1-藥物組A 值/對照組A 值)×100%

    1.5 聯(lián)合用藥濃度的選擇 根據(jù)增殖曲線,結(jié)合臨床上使用培美曲塞和β-欖香烯[6]的不同劑量和最大耐受量,我們選擇培美曲塞的最適濃度為76 μg/mL,β-欖香烯的最適濃度為125 μg/mL。

    1.6 MTT 法檢測培美曲塞聯(lián)合β-欖香烯對HeLa細(xì)胞的增殖情況 共分4 組,β-欖香烯組(125 μg/mL)、培美曲塞組(76 μg/mL)、聯(lián)合用藥組(培美曲塞組76 μg/mL、β-欖香烯組125 μg/mL)、空白對照組0 μg/mL,作用24 h。每個濃度設(shè)4 個復(fù)孔。實驗重復(fù)3 次,取均值計算增殖抑制率。

    1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測聯(lián)合用藥時細(xì)胞的凋亡情況取對數(shù)生長期的HeLa 細(xì)胞,以離心半徑13 cm、1000 r/min 離心5 min,用高糖DMEM(含10%胎牛血清)將細(xì)胞濃度調(diào)為1×106個/mL 細(xì)胞懸液后,接種于6孔板。4 組每孔加細(xì)胞懸液2 mL,放在37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中,細(xì)胞貼壁長到70%~80%后,按照不同組別分別加入培美曲塞和β-欖香烯。

    收集加藥后24h 的細(xì)胞培養(yǎng)基和貼壁細(xì)胞(懸浮細(xì)胞直接收集到離心管中,貼壁細(xì)胞用胰酶消化),細(xì)胞數(shù)不少于5×105個,收集細(xì)胞后以離心半徑13 cm、1000 r/min 離心5 min,根據(jù)Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記試劑盒說明,取195 μL 細(xì)胞懸液,加入5 μL Annexin V-FITC 混勻,室溫反應(yīng)10 min,PBS 洗細(xì)胞1次,在以190 μL 稀釋的結(jié)合緩沖液重懸,加10 μL 碘化丙啶染色液,輕輕混勻,隨即用流式細(xì)胞儀分析。流式細(xì)胞儀分析采集軟件:BD FACSDiva Software。使用兩藥相互作用系數(shù)(CDI)評價兩藥相互作用性質(zhì)[7]:

    CDI=E/(A×B)

    E 是兩藥聯(lián)合組與對照組吸光度比值,A 或B是各單藥組與對照組吸光度的比值。如果CDI <1,則兩藥作用性質(zhì)為協(xié)同;如果CDI=1,則兩藥作用性質(zhì)為相加;如果CDI >1,則兩藥作用性質(zhì)為拮抗。

    1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,兩組均數(shù)的比較采用t 檢驗,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,以P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 培美曲塞對HeLa 細(xì)胞增殖的影響 MTT 結(jié)果顯示38、76、152、228、304 μg/mL 濃度梯度范圍內(nèi),培美曲塞對HeLa 細(xì)胞有抑制作用,隨濃度上升,抑制作用增強。38、76、152、228 μg/mL 培美曲塞作用24 h時,對HeLa 細(xì)胞增殖抑制率兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05),228 μg/mL 培美曲塞與304 μg/mL培美曲塞抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05);38、76、152 μg/mL 培美曲塞作用48 h 時,對HeLa 細(xì)胞增殖抑制率兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。與152 μg/mL 培美曲塞比,228、304 μg/mL 培美曲塞48 h抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05);同一濃度,作用24 h 與48 h 對HeLa細(xì)胞增殖抑制率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。見表1。

    2.2 培美曲塞聯(lián)合β-欖香烯對HeLa 細(xì)胞增殖的影響 MTT 法結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組24 h 抑制率[(49.94±6.60)%]高于單獨使用β-欖香烯[(24.35±4.49)%]和培美曲塞[(10.69±4.80)%],差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.01)。聯(lián)合作用24 h 后,其兩藥相互作用系數(shù)(CDI)=0.74 <1,即聯(lián)合使用可協(xié)同抑制HeLa 細(xì)胞的增殖。

    2.3 聯(lián)合用藥對HeLa 細(xì)胞凋亡的影響 膜聯(lián)蛋白V(Annexin-V)是一種依賴性的磷脂結(jié)合蛋白,能與細(xì)胞凋亡過程中翻轉(zhuǎn)到膜外的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)高親和力特異性結(jié)合。利用Annexin-V 易與凋亡早期細(xì)胞膜表面PS 結(jié)合的特性,將AnnexinV 標(biāo)記熒光來檢測早期凋亡的細(xì)胞。與單獨用藥組相比,24 h 聯(lián)合用藥組可以使大部分細(xì)胞發(fā)生凋亡。見圖1。

    表1 培美曲塞對HeLa 細(xì)胞增殖的影響,%)Table 1 Effect of pemetrexed on the proliferation of HeLa cell

    表1 培美曲塞對HeLa 細(xì)胞增殖的影響,%)Table 1 Effect of pemetrexed on the proliferation of HeLa cell

    與同濃度作用24 h 時比較,*P <0.05

    培美曲塞濃度(μg/mL) n 24 h HeLa細(xì)胞增殖抑制率48 h 38 4 7.24±3.78 16.69±0.95*76 4 7.94±4.37 22.54±1.53*152 4 11.10±2.86 24.48±0.92*228 4 15.88±3.38 25.54±3.61*304 4 16.52±2.54 26.08±1.47*

    圖1 培美曲塞聯(lián)合欖香烯作用24 h 后HeLa 細(xì)胞的凋亡情況Figure 1 Apoptosis of HeLa cells treated by β-Elemene combined with Pemetrexed in 24 h

    3 討 論

    宮頸癌的病因可能與以下因素有關(guān):人乳頭瘤病毒感染[8-10]、性行為、產(chǎn)次[1]、其他病原體感染[11]和一些協(xié)同因素,比如吸煙。宮頸癌的治療主要包括手術(shù)及放射治療,過去認(rèn)為宮頸癌屬于化療不敏感腫瘤,但近年來,化療已成為輔助治療的常用方法[12]。

    培美曲塞是一種常用的化療藥和多靶點的抗代謝類藥物[13-14],可通過抑制合成堿基的相關(guān)葉酸依賴酶系,干擾DNA 及RNA 的合成來抑制腫瘤細(xì)胞生長[15]。例如,培美曲塞可通過抑制胸苷酸合成酶的合成,使DNA 合成所必須的可利用的胸腺嘧啶減少,從而造成細(xì)胞增殖下降,特別是在快速增殖的腫瘤細(xì)胞中[16]。培美曲塞主要用于治療不宜手術(shù)的惡性胸腹膜間皮瘤[17],也可用于其他一些腫瘤,包括宮頸癌、胃癌、胰腺癌等[18]。在使用培美曲塞時會出現(xiàn)一定的骨髓抑制[19]、過敏、腹瀉等不良反應(yīng)。

    β-欖香烯具有較好的抗腫瘤作用,可抑制肝癌HepG2 細(xì) 胞[20-21]、膠 質(zhì) 瘤[22]等 腫 瘤 細(xì) 胞 增 殖。β-欖香烯抗腫瘤的機制復(fù)雜,例如,直接細(xì)胞毒作用、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、影響癌細(xì)胞核酸代謝、增強機體免疫、瘤苗主動免疫和影響癌細(xì)胞膜電位[23];另外,還可通過扭轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和多藥耐藥以及誘導(dǎo)細(xì)胞自噬起到抗腫瘤的作用[24],且在用藥過程中不發(fā)生骨髓抑制,而且還會改善化療藥物所致的骨髓抑制等不良反應(yīng)[25]。

    本文通過β-欖香烯聯(lián)合培美曲塞聯(lián)合使用,以體外培養(yǎng)的HeLa 細(xì)胞為模型,利用MTT、流式細(xì)胞術(shù)檢測β-欖香烯聯(lián)合培美曲塞聯(lián)合使用對HeLa 細(xì)胞增殖和凋亡的作用。MTT 結(jié)果顯示,當(dāng)兩藥聯(lián)合應(yīng)用時,聯(lián)合用藥組24 h 抑制率要顯著高于單獨使用β-欖香烯和培美曲塞組,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)β-欖香烯聯(lián)合培美曲塞可以協(xié)同促進HeLa 細(xì)胞凋亡。這提示我們,β-欖香烯和培美曲塞聯(lián)合治療宮頸癌時,不但抗癌作用明顯,且β-欖香烯和培美曲塞聯(lián)合能起到增效減毒的作用。

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