低氧對(duì)新生隱球菌生物膜的影響

李宗輝，孔慶濤，杜 雪，鄧 琳，胡治麗，桑 紅

0 引 言

近年來(lái)，隨著廣譜抗生素和免疫抑制劑的大量使用、人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染和器官移植患者的增加、侵入性醫(yī)療裝置應(yīng)用，系統(tǒng)性真菌感染不斷增加。新生隱球菌是種在環(huán)境中廣泛分布的機(jī)會(huì)性致病真菌，特別在免疫缺陷患者中可引起致命性腦膜腦炎，致死率高達(dá)90%［1］。新生隱球菌主要的毒力因子有莢膜、產(chǎn)黑素、尿素酶和磷脂酶的毒性作用及其在宿主體溫環(huán)境生長(zhǎng)的能力等。近年發(fā)現(xiàn)，生物膜成為許多微生物的主要毒力因子［2］。生物膜是微生物群體黏附到物質(zhì)表面并包裹有細(xì)胞外聚合物的基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，近65%的人類感染與生物膜相關(guān)［3］。與浮游細(xì)胞相比，生物膜細(xì)胞對(duì)抗菌因子及宿主抵抗因子的抵抗力明顯增加。近年有學(xué)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)新生隱球菌可在房室分流裝置和氣管食管聲音假體上形成生物膜［4－7］。真菌生物膜的形成與成熟受到多種因素的影響，包括pH 值、溫度、滲透壓、周圍基質(zhì)的化學(xué)成分、流動(dòng)性、支持物類型、細(xì)菌、宿主的免疫狀態(tài)、氧氣及環(huán)境變化等［8－9］。研究表明，在pH 為7.0 的中性環(huán)境中，白念珠菌黏附聚苯乙烯表面的能力更強(qiáng);在厭氧環(huán)境及缺氧條件下，念珠菌可以形成生物膜而導(dǎo)致多種感染，并對(duì)抗真菌藥物有更高的耐藥性［10］。新生隱球菌是專性需氧微生物，在大氣氧濃度(21%)條件下生長(zhǎng)最佳，而人腦組織中氧濃度僅約3%左右［11－12］。因此新生隱球菌致病過(guò)程中必須面對(duì)宿主組織不同氧濃度的變化。國(guó)內(nèi)外研究大多集中在新生隱球菌低氧適應(yīng)的機(jī)制［13－14］，但低氧對(duì)新生隱球菌主要毒力因子的影響及其機(jī)制尚不清楚。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)新生隱球菌在低氧條件下重要致病表型發(fā)生變化，即莢膜和黑素形成減少、尿素酶和磷脂酶活性降低［15－16］。本研究進(jìn)一步探討了低氧對(duì)新生隱球菌重要毒力因子生物膜的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 新生隱球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H99(血清型A，交配型α)由衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)微生物菌(毒)種保藏管理中心真菌中心(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所)饋贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基 沙氏固體培養(yǎng)基和酵母浸膏液體培養(yǎng)基、DMEM 液體培養(yǎng)基(含4500 mg/L D-葡萄糖，584 mg/L L-谷氨酰胺，110 mg/L 丙酮酸鈉，3700 mg/L 碳酸氫鈉，100 U/mL 青霉素，100 μg/mL 鏈霉素)購(gòu)自南京凱基生物膜公司。

1.1.3 主要試劑及儀器 MTT、Hepes、維生素K3(Sigma 公司提供)，F(xiàn)UN-1 染色劑(美國(guó)Invitrogen公司)，PBS 緩沖液(上海Generay biotech 公司)。0.22 μm 微孔濾膜(Millipore 公司)，細(xì)胞爬片(美國(guó)Thermo)，24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Corning 公司)，直徑13 mm 的細(xì)胞爬片(美國(guó)Thermo 公司)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板(上海求精儀器股份有限公司)，光學(xué)顯微鏡、共聚焦激光掃描顯微鏡FV-1000(日本，OLYMPUS 公司)，掃描電子顯微鏡(日本，日立TM-1000)，酶標(biāo)儀(美國(guó)，Thermo 公司)。厭氧培養(yǎng)箱(長(zhǎng)沙華曦電子科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌液制備 菌株于沙氏培養(yǎng)基－70 ℃保存，在實(shí)驗(yàn)前將其取出，轉(zhuǎn)種于沙氏培養(yǎng)基中活化3 d，取菌落于30 ℃酵母浸膏培養(yǎng)基中搖動(dòng)生長(zhǎng)18 ～20 h，離心收取菌落(離心半徑80 mm，5000 r/min，5 min)，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3 次。利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，DMEM 液體培養(yǎng)基稀釋制成pH7.4 的1×107個(gè)/mL 菌懸液。

1.2.2 光鏡觀察不同氧濃度下新生隱球菌體外生物膜形成 向24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入500 μL的新生隱球菌菌懸液，分別置于大氣氧條件為正常氧濃度(21%)和1%氧濃度的條件下，37 ℃培養(yǎng)，分別在接種的2、4、8、12、24、48、72 h 吸棄培養(yǎng)基，無(wú)菌PBS 沖洗3 次，以除去未黏附的隱球菌細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡下觀察培養(yǎng)板上的生物膜結(jié)構(gòu)。

1.2.3 共聚焦激光掃描顯微鏡觀察新生隱球菌體外生物膜形成 將直徑13 mm 無(wú)菌細(xì)胞爬片放入24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入500 μL 的新生隱球菌菌懸液，分別置于大氣氧條件和1%氧濃度的條件下，37 ℃培養(yǎng)，分別在2、4、8、12、24、48、72 h，將細(xì)胞爬片取出，無(wú)菌PBS 沖洗3 次。向上述細(xì)胞爬片表面加入100 μL 25 μmol/L 的FUN-1 染色劑，常溫下避光孵育30 min。PBS 清洗細(xì)胞爬片3 次，將其反扣置于載玻片上，使用共聚焦激光激光掃描顯微鏡，488 nm 氬離子激光激發(fā)，沿z 軸觀察生物膜XY 平面的形態(tài)及成熟新生隱球菌生物膜在不同氧濃度下的厚度。每張細(xì)胞爬片上取3 個(gè)視野，收集圖像處理數(shù)據(jù)。

1.2.4 新生隱球菌體外生物膜生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)測(cè)定將100 μL 細(xì)胞懸液接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別置于正常氧濃度和1%氧濃度的條件下，37 ℃培養(yǎng)，分別于接種后2、4、8、12、24、48、72 h 吸棄培養(yǎng)基，無(wú)菌PBS 沖洗3 次，以除去黏附的隱球菌細(xì)胞，用四甲基偶氮唑鹽(MTT)降解法測(cè)定新生隱球菌H99 不同時(shí)間生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)改變。每孔加入50 μL MTT 溶液(用PBS 配制成濃度為1 mg/mL)和4 μL甲萘醌溶液(用丙酮配制成濃度為1 mmol/L)，37 ℃避光培養(yǎng)5 h。酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm 處含生物膜的各孔的A 值，每個(gè)條件均設(shè)3 個(gè)孔，取平均值。取含預(yù)先加熱殺死的新生隱球菌細(xì)胞及DMEM 培養(yǎng)基的96 孔板作為陰性對(duì)照孔。既往研究已經(jīng)證明了MTT 降解分析測(cè)量值與生物膜真菌細(xì)胞數(shù)相一致［17］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用兩因素方差分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 光鏡下新生隱球菌生物膜的形態(tài)觀察 在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在1%氧濃度和正常氧濃度下均可生長(zhǎng)形成成熟的生物膜。正常氧濃度下，在2 ～4 h為孢子黏附階段，2 h 開始便有孢子黏附于細(xì)胞爬片上，隨后孢子的黏附數(shù)量逐漸增多，部分孢子體積增大，形成稀疏的單細(xì)胞層;8 ～12 h 進(jìn)入微菌落形成階段，細(xì)胞爬片上不斷形成多個(gè)微小的細(xì)胞群落，12 h后各群落的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，并向四周擴(kuò)展、增厚;12 ～24 h 進(jìn)入生物膜的成熟階段，細(xì)胞進(jìn)一步增多，隨著圍繞在細(xì)胞周圍的細(xì)胞外基質(zhì)的增加，新生隱球菌的微結(jié)構(gòu)變得更加復(fù)雜，產(chǎn)生了緊密黏附在細(xì)胞爬片上的致密結(jié)構(gòu)。1%氧濃度條件下新生隱球菌生物膜形成過(guò)程與正常氧濃度下類似，但在相同時(shí)間點(diǎn)下，其生物膜的厚度及生物膜細(xì)胞數(shù)量均較正常氧濃度下的有所增加。在24 h 后生物膜的形態(tài)基本趨于穩(wěn)定，48 h 與72 h 時(shí)不同氧濃度中形成生物膜的差異不大。見圖1。

2.2 共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察新生隱球菌體外生物膜形成 共聚焦激光顯微鏡結(jié)果顯示與光鏡一致，2 種受試氧濃度條件下，生物膜均經(jīng)歷黏附、聚集、微菌落形成及生物膜成熟的過(guò)程，從而形成厚度相對(duì)穩(wěn)定、包裹有細(xì)胞外多聚基質(zhì)的成熟致密的生物膜，見圖2。與正常氧濃度相比，1%氧濃度條件下各時(shí)間點(diǎn)生物膜細(xì)胞密度更大，最終兩者都可形成厚度約16 μm 的生物膜，見圖3。

2.3 新生隱球菌體外生物膜的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)應(yīng)用MTT 檢測(cè)新生隱球菌體外生物膜活性檢測(cè)顯示，相同生長(zhǎng)條件下，在0 ～24 h 內(nèi)新生隱球菌生物膜的代謝活性隨時(shí)間增長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，這與其細(xì)胞量的增加相一致;至第1 ～3 天，各時(shí)間點(diǎn)生物膜活性保持在較高水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。應(yīng)用重復(fù)序列方差分析，與1%氧濃度相比，正常氧濃度條件下新生隱球菌H99 所形成的生物膜在各時(shí)間點(diǎn)的代謝活性均明顯減小，各時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見表1。

圖1 光鏡下觀察不同時(shí)間點(diǎn)新生隱球菌H99 生物膜生物膜的結(jié)構(gòu)變化(×40)Figure 1 Structures of the Cryptococcus neoformans H99 biofilms after exposed to 1%or 21%oxygen for different hours(×40)

圖2 共聚焦激光掃描顯微鏡下不同時(shí)間點(diǎn)新生隱球菌H99 生物膜結(jié)構(gòu)變化(FUN-1 ×40)Figure 2 Structures of the Cryptococcus neoformans H99 biofilms after exposed to 1%or 21%oxygen for different hours(FUN-1 ×40)

表1 不同氧濃度下各時(shí)間點(diǎn)新生隱球菌生物膜的A 值比較(x±s)Table 1 Absorbance value of the Cryptococcus neoformans biofilms after exposed to 1%or 21%oxygen for different hours

表1 不同氧濃度下各時(shí)間點(diǎn)新生隱球菌生物膜的A 值比較(x±s)Table 1 Absorbance value of the Cryptococcus neoformans biofilms after exposed to 1%or 21%oxygen for different hours

與1%氧濃度比較，*P ＜0.05

氧條件 n 2 h 4 h 8 h新生隱球1菌2生h物膜的A值24 h 48 h 72 h 1%氧濃度 3 0.150±0.005 0.276±0.006 0.435±0.018 0.536±0.013 0.608±0.006 0.602±0.004 0.610±0.005正常氧濃度 3 0.129±0.005* 0.232±0.006* 0.366±0.006* 0.475±0.009* 0.530±0.010* 0.534±0.008* 0.528±0.007*

圖3 共聚焦激光掃描顯微鏡下培養(yǎng)第48 h 形成的新生隱球菌H99 生物膜圖像(×40)Figure 3 Cryptococcus neoformans H99 biofilms after exposed to 1%or 21%oxygen for 48 hours under the confocal laser scanning microscope(×40)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)首次用低氧條件構(gòu)建了新生隱球菌生物膜的體外模型，并與正常氧條件下形成的隱球菌生物膜進(jìn)行了比較。光鏡及共聚焦激光掃描顯微鏡觀察結(jié)果表明，不論在正常氧還是低氧條件下新生隱球菌均能在體外模型中生長(zhǎng)、形成成熟的生物膜，兩種條件下生物膜均經(jīng)歷黏附、聚集、微菌落形成及生物膜成熟的過(guò)程，最終形成厚度相對(duì)穩(wěn)定，包裹有細(xì)胞外多聚基質(zhì)的成熟的致密的生物膜，厚度約為16 μm，生物膜的形成過(guò)程及厚度與國(guó)外學(xué)者的報(bào)導(dǎo)基本一致［18－20］。與正常氧條件相比，低氧條件下各時(shí)間點(diǎn)生物膜細(xì)胞密度有所增加。同時(shí)，MTT 法對(duì)2種狀態(tài)下新生隱球菌生物膜的生長(zhǎng)活性進(jìn)行了觀測(cè)，并證實(shí)其生長(zhǎng)活性隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而明顯增強(qiáng)，達(dá)到一定成熟度后逐漸穩(wěn)定;低氧條件下新生隱球菌形成生物膜的能力高于正常氧條件下，與顯微鏡觀察結(jié)果一致，說(shuō)明低氧條件促進(jìn)了生物膜的生長(zhǎng)，并可能對(duì)其毒力產(chǎn)生一定影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示氧濃度在新生隱球菌生物膜的形成過(guò)程中起著重要的作用，并可導(dǎo)致生物膜密度的改變。

低氧狀態(tài)下真菌生物膜的形成與多種分子機(jī)制相關(guān)。例如，白念珠菌生物膜黏附相關(guān)基因TYE7，編碼糖酵解基因的轉(zhuǎn)錄活化因子，能影響低氧條件下生物膜的絲化現(xiàn)象［21］;新生隱球菌CRZ1/SP1 樣基因，能通過(guò)對(duì)細(xì)胞壁和莢膜形成的作用，來(lái)影響其生物膜內(nèi)部低氧狀態(tài)的適應(yīng)能力，以影響細(xì)胞膜形成［22］。而在低氧條件下，這些因子在新生隱球菌生物膜形成中的具體機(jī)制，尚待深入探索。此外，真菌的其他生物膜形成相關(guān)基因，如ALS、SAP、PLB、FKS1、BGL2、PHR1、XOG1 等，是否在低氧適應(yīng)中起到作用也待探討。

新生隱球菌在感染宿主的過(guò)程中，必須適應(yīng)宿主不同組織中氧濃度的變化，而生物膜的形成也必須適應(yīng)這種變化。本實(shí)通過(guò)建立低氧濃度培養(yǎng)條件下新生隱球菌生物膜的體外模型，并與正常氧條件下的生物膜進(jìn)行比較，對(duì)低氧條件下生物膜的形成過(guò)程、基本結(jié)構(gòu)和特性有了初步的了解，但其在致病過(guò)程中的具體作用及可能涉及的分子作用機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

［1］ Pettit RK，Repp KK，Hazen KC.Temperature affects the susceptibility of Cryptococcus neoformans biofilms to antifungal agents［J］.Med Mycol，2010，48(2):421-426.

［2］ Fanning S，Mitchell AP.Fungal Biofilms［J］.PLoS Pathog，2012，8(4):e1002585.

［3］ Ramage G，Williams C.The clinical importance of fungal biofilms［J］.Adv Appl Microbiol，2013，84:27-83.

［4］ Walsh TJ，Schlegel R，Moody MM，et al.Ventriculoatrial shunt infection due to Cryptococcus neoformans:an ultrastructural and quantitative microbiological study［J］.Neurosurgery，1986，18(3):373-375.

［5］ Bauters TG，Swinne D，Stove V，et al.Detection of single cells of Cryptococcus neoformansin clinical samples by solid-phase cytometry［J］.J Clin Microbiol，2003，41(4):1736-1737.

［6］ Waltham MC，Cornell BA，Smith R.Associationof ferri-and ferrocytochrome c with lipid multilayers:a 31P solid-state NMR study［J］.Biochim Biophys Acta，1986，862(2):451-456.

［7］ Ramage G，Rajendran R，Sherry L，et al.Fungal Biofilm Resistance［J］.Int J Microbiol，2012:528521.

［8］ Ramage G，Wickes BL，Lopez-Ribot JL.A seed and feed model for the formation of Candida albicans biofilms under flow conditions using an improved modified Robbins device［J］.Rev Iberoam Micol，2008，25(1):37-40.

［9］ Martinez LR，Casadevall A.Susceptibility of Cryptococcus neoformans biofilms to antifungal agents in vitro［J］.Antimicrob Agents Chemother，2006，50(3):1021-1033.

［10］ Kumar CP，Menon T.Biofilm product ion by clinical isolates of Candida species［J］.Med Mycol，2006，44(1):99-101.

［11］ Grahl N，Shepardson KM，Chung D，et al.Hypoxia and fungal pathogenesis:to air or not to air?［J］Eukaryot Cell，2012，11(5):560-570.

［12］ Moranova Z，Kawamoto S，Raclavsky V.Hypoxia sensing in Cryptococcus neoformans:biofilm-like adaption for dormancy?［J］Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub，2009，153(3):189-193.

［13］ Chun CD，Liu OW，Madhani HD.A link between virulence and homeostatic responses to hypoxia during infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans［J］.PLoS Pathog，2007，3(2):225-238.

［14］ Chang YC，Bien CM，Lee H，et al.Sre1p，a regulator of oxygen sensing and sterol homeostasis，is required for virulence in Cryptococcus neoformans［J］.Mol Microbiol，2007，64(3):614-629.

［15］ 孔慶濤，桑 紅，劉 芳，等.不同氧濃度對(duì)新生隱球菌莢膜的影響［J］.中華皮膚科雜志，2013，46(8):547-550.

［16］ 孔慶濤，桑 紅.新生隱球菌氧傳感途徑的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2013，26(10):1080-1082.

［17］ Martinez LR，Casadevall A.Cryptococcus neoformansbiofilm formation depends on surface support and carbon source and reduces fungal cell susceptibility to heat，cold，and UV light［J］.Appl Environ Microbiol，2007，73(14):4592-4601.

［18］ 徐元玲，王建東，蔣琪霞.慢性傷口細(xì)菌生物膜的臨床識(shí)別和影響因素的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2014，27(12):1337-1339.

［19］ Ravi S，Pierce C，Witt C，et al.Biofilm formation by Cryptococcus neoformans under distinct environmental conditions［J］.Mycopathologia，2009，167(6):307-314.

［20］ Martinez LR，Casadevall A.Susceptibility of Cryptococcus neoformans biofilms to antifungal agents in vitro［J］.Antimicrob Agents Chemother，2006，50(3):1021-1033.

［21］ Bonhomme J，Chauvel M，Goyard S，et al.Contribution of the glycolytic flux and hypoxia adaptation to efficient biofilm formation by Candida albicans［J］.Mol Microbiol，2011，80(4):995-1013.

［22］ Moranova Z，Virtudazo E，Hricova K，et al.The CRZ1/SP1-like gene links survival under limited aeration，cell integrity and biofilm formation in the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans［J］.Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub，2014，158(2):212-220.