RNA 干擾Cofilin-1 基因沉默對(duì)人肝癌細(xì)胞株Huh-7侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響

曹建平，龍曉蘭，龔 勇，李曉杰，謝海龍

0 引 言

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是嚴(yán)重威脅人類生命的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在各種類型惡性腫瘤中更是位居前列，超過50%的新發(fā)病例發(fā)生在中國(guó)［1－2］。HCC 早期并無特征表現(xiàn)，早期發(fā)現(xiàn)難，一旦出現(xiàn)癥狀大部分已發(fā)生轉(zhuǎn)移［3］。雖然綜合治療HCC 的措施不斷改善，但HCC 患者預(yù)后仍然很差［4］。因此深入研究HCC 的發(fā)病機(jī)理，探討HCC 的早期轉(zhuǎn)移及其高侵襲生長(zhǎng)的分子病理機(jī)制，發(fā)現(xiàn)病理過程中的重要環(huán)節(jié)和關(guān)鍵分子，尋找具有HCC 治療價(jià)值的藥物靶點(diǎn)，將對(duì)HCC 的腫瘤生物學(xué)研究、藥物研發(fā)及臨床治療奠定基礎(chǔ)。

Cofilin-1 基因定位于11q13，其編碼的蛋白質(zhì)分子量為19 kDa，是一種細(xì)胞骨架蛋白，屬于肌動(dòng)蛋白解聚因子家族。Cofilin-1 在促進(jìn)肌動(dòng)蛋白解聚/聚合和肌動(dòng)蛋白絲的快速周轉(zhuǎn)中發(fā)揮重要作用［5］。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組參與腫瘤進(jìn)展、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞粘著、細(xì)胞侵襲和血管生成。在癌細(xì)胞中抑制Cofilin-1 活性能使細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力下降［6］。下調(diào)Cofilin-1 蛋白表達(dá)的降低了侵襲偽足組裝及其穩(wěn)定性，表明Cofilin-1 在細(xì)胞侵襲過程中起至關(guān)重要的作用［7］。Cofilin-1 在多種腫瘤中存在高表達(dá)，參與這些腫瘤的發(fā)病過程［8－9］。但該基因在HCC 中表達(dá)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道少，本研究擬通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)Cofilin-1 在HCC 組織中的表達(dá)，并通過基因沉默技術(shù)觀察Cofilin-1 基因表達(dá)下調(diào)后對(duì)人肝癌細(xì)胞株Huh-7 遷移和侵襲的影響，探討Cofilin-1在HCC 發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和組織標(biāo)本 細(xì)胞:Huh-7 細(xì)胞是人肝癌細(xì)胞，原購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)集存庫，由本實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞均用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。組織:收集郴州市第一人民醫(yī)院病理科2009 年1 月至2013 年2 月肝癌標(biāo)本30 例，所有患者術(shù)前均未接受放化療處理，均經(jīng)病理證實(shí)為肝細(xì)胞癌。30 例肝癌中伴有肝硬化18 例。根據(jù)Edmondson 肝癌分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)，其中Ⅰ級(jí)5 例，Ⅱ級(jí)12 例，Ⅲ級(jí)13 例。年齡為17 ～71 歲，平均年齡(56.8±2.0)歲，其中男21 例，女9 例。取癌和癌旁＜1 cm 范圍內(nèi)正常組織，凍存于－80 ℃。

1.2 主要試劑 DMEM、胎牛血清、DMSO 均購(gòu)自Gibco 公司;細(xì)胞培養(yǎng)皿、Tip 頭、凍存管、孔板購(gòu)自Corning 公司;細(xì)胞裂解液，Trizol 試劑，購(gòu)自Invitrogen公司;BCA 蛋白分析試劑盒(BCA protein Kit)購(gòu)自Pierce 公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒均購(gòu)自TaKa-Ra 公司;DEPC 水購(gòu)自Invitrogen 公司;HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG(H+L)抗體和HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體購(gòu)自上?？党枪?Cofilin-1 抗體購(gòu)自Santa Cruz;所有引物均由上海Invitrogen 公司合成;siRNA序列由上海吉瑪公司合成;Transwell 小室(pore size:8.0 μm)及Matrigel 均購(gòu)自BD Bioscience 公司。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)Cofilin-1 在肝癌組織中的表達(dá)

1.3.1 組織總RNA的提取 將組織塊直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，液氮揮發(fā)完后再加入少量液氮，如此反復(fù)研磨至組織塊成細(xì)粉末狀，轉(zhuǎn)入離心管中，加入Trizol(50 ～100 mg/mL Trizol)，然后用帶7 號(hào)針頭的5 mL 注射器抽吸8 ～10 次，再轉(zhuǎn)入新的EP 管中，充分吹打至不黏稠后移至去除RNA 酶的1.5 mL EP 管中;加入0.2 mL/管新開封的氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫孵育5 min，4 ℃，12000×g，離心15 min;將上清移至新的1.5 mL EP 管中，加入0.5 mL/管的異丙醇，－20 ℃孵育20 min，4 ℃，12 000×g 離心10 min;去除上清，75%乙醇1 mL/管洗滌，4 ℃，7500×g 離心5 min;室溫干燥10 ～20 min，用DEPC 處理后的無RNA 酶H2O 溶解沉淀，分光光度計(jì)定量RNA。

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 引物由上海Invitrogen設(shè)計(jì)及合成。Cofilin-1 基因引物序列上游:5'-GACTGCCGCTATGCCCTCTATG，下 游:5'-CTTCTTCTTGATGGCGTCCTTG;看家基因β-actin 引物序列上游:5' TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA，下游:5'-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR與相對(duì)定量分析在冰上制備反應(yīng)液:5×PrimerScriptTMBuffer 2.0 μL、Random 6 mers(100 μmol/L)0.5 μL、Primer ScriptTMRT Enzyme Mix 0.5 μL、Oligo dT Primer(50 μmol/L)0.5 μL，加入模板RNA 1 μL(500 ng/μL)，補(bǔ)Rnase Free H2O 至10 μL，37 ℃培養(yǎng)15 min，85 ℃5 s 使反轉(zhuǎn)錄酶滅活。Real-Time PCR 所用SYBR Premix EX TaqTM 購(gòu)自TaKaRa 公司。10 μL 反應(yīng)體系:SYBR Premix Ex Taq(2×)5 μL，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.4 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.4 μL，ROX Reference Dye(50×)0.2 μL，模板1 μL，dH2O 3 μL。反應(yīng)條件:95 ℃30 s;95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán);95 ℃15 s，60 ℃30 s，95 ℃15 s。使用ABI PRISM 7900HT 儀器。相對(duì)定量采用比較CT(Cycle threshold)法。計(jì)算公式:

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 由上海吉瑪公司合成cofilin-1 siRNA 序列。cofilin-1-RNA 序列:正義鏈為:5'-GGUGUCAUCAAGGUGUUCATT-3';反義鏈為:5'-UGAACACCUUGAUGACACCTT-3'。非特異性siRNA(CtrlsiRNA)為吉瑪公司提供。利用LipofectamineTM2000將cofilin-1-siRNA 和非特異性siRNA(Ctrl-siRNA)轉(zhuǎn)染Huh-7 細(xì)胞形成cofilin-1-siRNA 組和Ctrl-siRNA 組，未轉(zhuǎn)染Huh-7 細(xì)胞為空白對(duì)照組。具體操作如下:將1×通用緩沖液125 μL，加入到2.5 nmol 的雙鏈siRNA 中，得到siRNA 母液，濃度為20 μmol/L。工作母液放置于90 ℃2 min，自然冷卻至室溫，然后放于4 ℃過夜備用。轉(zhuǎn)染前一天，細(xì)胞傳代培養(yǎng)于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 至細(xì)胞鋪滿孔底的40%～50%。將6 μL 20 μmol/L 的siRNA 雙鏈與100 μL 無血清DMEM 混合于無菌的eppendoff 管中。LipofectamineTM2000 試劑(1 μg/μL)搖勻取3 μL，與100 μL 無血清DMEM 混合于另一無菌eppendorf管中。將上述兩管液體在5 min 內(nèi)混合，并混勻，室溫靜置至少20 min，形成siRNA-Lipofectamine 復(fù)合物。6 孔板細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，加入含10%FCS 的DMEM 1 mL，然后將上述配制的混合物200 μL 分別加入各孔中，使轉(zhuǎn)染終濃度為100 nmol/L。然后將細(xì)胞于37 ℃，5%CO2的細(xì)胞孵箱中孵育48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 Western-blot 檢測(cè)Huh-7 細(xì)胞cofilin-1 蛋白的表達(dá) 各個(gè)樣品取20 μg 加入上樣孔。12%的SDS-PAGE 膠分離樣品，轉(zhuǎn)膜，PVDF 膜入5%PBST 脫脂奶粉液中，室溫封閉2 h。然后將PVDF膜依照Mark 裁剪成條，小鼠抗人Cofilin-1 抗體按1∶200 稀釋，小鼠抗人GAPDH 抗體按1∶10000 稀釋，分別孵育對(duì)應(yīng)的膜上，4 ℃過夜。次日，用0.5%PBST 分 別 洗 滌PVDF 膜3 次，10 min/次。HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體1 ∶2000 稀釋，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 抗體1∶2000 稀釋，孵育對(duì)應(yīng)膜上，室溫1 h。然后PBST 洗膜3 次，10 min/次。ECL，暗室曝光后顯影定影，掃描膠片。凝膠圖像分析:將膠片進(jìn)行掃描，用Image J 軟件對(duì)膠片進(jìn)行灰度分析，計(jì)算3 組細(xì)胞中目標(biāo)蛋白和內(nèi)參的電泳條帶灰度比值，對(duì)不同細(xì)胞中目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行分析。

1.6 體外細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 用0.25%胰酶消化細(xì)胞，用含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基收集細(xì)胞至1.5 mL EP 管中，用不含血清的培養(yǎng)基洗細(xì)胞3 次，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用無血清培養(yǎng)基(含0.1%BSA)配成5×105個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液。在24 孔培養(yǎng)板中加入500 μL含有10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，將Transwell 小室放入，為了免減弱遷移作用，下層培養(yǎng)基和小室間不要產(chǎn)生氣泡，在小室內(nèi)加入200 μL 細(xì)胞懸液，蓋好培養(yǎng)板。將Transwell 培養(yǎng)板放置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，孵育8 h。取出Transwell 小室，去除小室內(nèi)的液體，將小室放入加有500 μL 4%多聚甲醛的孔中固定，室溫下1 h 后去除小室內(nèi)的液體，放入加有500 μL 0.1%結(jié)晶紫的孔中，使膜浸沒在結(jié)晶紫中，染色30 min，PBS 洗2 遍，棉簽擦去小室內(nèi)的細(xì)胞(不可碰觸小室的外底部)，PBS 洗2 遍。晾干，將小室放入干凈的24 孔培養(yǎng)板中，在倒置顯微鏡下觀察。隨機(jī)取5 個(gè)高倍鏡視野，照相、計(jì)數(shù)。

1.7 體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將BD matrigel(凍存于－20 ℃冰箱)放到4 ℃融解，過夜。用預(yù)冷的Tip頭、移液管，將融解好的Matrigel 用4 ℃的無血清培養(yǎng)基以1∶8 稀釋，混勻。在Transwell 小室內(nèi)均勻鋪100 μL 稀釋的Matrigel，Transwell 小室放入24 孔培養(yǎng)板中，在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，孵育4 h，使之形成一層均勻的薄層凝膠。用無血清培養(yǎng)基輕洗薄層凝膠2 遍。配制2.5×106個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，在小室內(nèi)加入200 μL 細(xì)胞懸液，蓋好培養(yǎng)板。Transwell 培養(yǎng)板放置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，孵育14 h。其他步驟與方法同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，組間均值的比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝癌組織與癌旁組織中Cofilin-1 mRNA 表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果 Cofilin-1 在肝癌組織的表達(dá)顯著高于癌旁組織［(3.523±0.412)vs(0.698±0.156)］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.2 Cofilin-1-siRNA 轉(zhuǎn)染對(duì)Huh-7 細(xì)胞Cofilin-1蛋白表達(dá)的影響 干擾6 h 后，觀察羧基熒光素(Carboxyfluorescein，F(xiàn)AM)熒光圖，干擾效果達(dá)90%以上，見圖1。Cofilin-1-siRNA 組Cofilin-1 的蛋白量為0.558±0.033，明顯低于Ctrl-siRNA 組0.933±0.015 與未轉(zhuǎn)染組0.961±0.020，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);Ctrl-siRNA 組與未轉(zhuǎn)染組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見圖2。

圖1 Cofilin-1-siRNA 轉(zhuǎn)染Huh-7 細(xì)胞的熒光圖(×100)Figure 1 Immunofluorescence figures of Huh-7 cells tranfected with FAM Cofilin-1-siRNA(×100)

圖2 Huh-7 細(xì)胞Cofilin-1 蛋白的Western-blot 檢測(cè)結(jié)果Figure 2 Western blot analysis of the expression of Cofilin-1 protein in Huh-7 cells

2.3 Cofilin-1-siRNA 轉(zhuǎn)染對(duì)Huh-7 細(xì)胞體外遷移的影響 體外細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:Cofilin-1-siRNA 組穿膜Huh-7 細(xì)胞數(shù)為［(58.50±1.78)個(gè)］，明顯低于Ctrl-siRNA 組［(79.00±1.33)個(gè)］和未轉(zhuǎn)染組［(74.50±1.35)個(gè)］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);Ctrl-siRNA 組與未轉(zhuǎn)染組穿膜Huh-7 細(xì)胞數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，見圖3。

2.4 Cofilin-1-siRNA 轉(zhuǎn)染對(duì)Huh-7 細(xì)胞體外侵襲的影響 體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:Cofilin-1-siRNA 組穿膜Huh-7 細(xì)胞數(shù)為［(36.50±0.83)個(gè)］，明顯低于Ctrl-siRNA 組［(60.20±1.60)個(gè)］和未轉(zhuǎn)染組［(51.50±1.14)個(gè)］，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);Ctrl-siRNA 組與未轉(zhuǎn)染組穿膜Huh-7 細(xì)胞數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見圖4。

圖3 3 組細(xì)胞Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)圖(×100)Figure 3 The figures of transwell migration assay of cells in the three groups(×100)

圖4 3 組細(xì)胞Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)圖(×100)Figure 4 The figures of transwell invasion assay of cells in the three groups(×100)

3 討 論

HCC 是最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在各種類型惡性腫瘤中更是位居前列［1］。而目前的治療效果不理想，因此，尋找具有HCC 治療價(jià)值的藥物靶點(diǎn)，將對(duì)HCC 的臨床治療奠定基礎(chǔ)。

Cofilin 基因具有2 種亞型，Cofilin-1 是其中之一，在腦和肝臟表達(dá)豐度最高。Cofilin-1 在促進(jìn)肌動(dòng)蛋白解聚/聚合和肌動(dòng)蛋白絲的快速周轉(zhuǎn)中發(fā)揮重要 作 用［5］。在 胰 腺 癌［10］、口 腔 鱗 癌［11］、乳 腺癌［12］、膽囊癌［13］、肺癌［14］、卵巢癌［8］中，Cofilin-1 呈過表達(dá)。Cofilin-1 可預(yù)測(cè)早期卵巢上皮性癌(卵巢癌)治療成功者的預(yù)后，Cofilin-1 表達(dá)低的患者生存期要長(zhǎng)于Cofilin-1 表達(dá)高的患者［8］。由此可見，Cofilin-1的表達(dá)與腫瘤的遷移、侵襲有關(guān)。本研究30 例肝癌患者中Cofilin-1 在癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，表明Cofilin-1 基因高表達(dá)可能與肝癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組參與腫瘤進(jìn)展、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞粘著、細(xì)胞侵襲和血管生成。在癌細(xì)胞中抑制Cofilin-1 活性能使細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力下降［6］。下調(diào)Cofilin-1 蛋白表達(dá)的降低了侵襲偽足組裝和的穩(wěn)定性，表明Cofilin-1 在細(xì)胞侵襲了起至關(guān)重要的作用［7，15－16］。RNA 干擾已經(jīng)成為功能基因組研究的有力工具，本研究采用Cofilin-1-siRNA 干擾Huh-7細(xì)胞中Cofilin-1 基因表達(dá)，結(jié)果提示:Cofilin-1-siRNA 組Cofilin-1 的蛋白量明顯低于Ctrl-siRNA 組與未轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，這說明本研究采用的Cofilin-1-siRNA 干擾效果好。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步應(yīng)用體外細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Cofilin-1-siRNA 干擾細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果顯示Cofilin-1-siRNA 組細(xì)胞的遷移修復(fù)能力遠(yuǎn)低于Ctrl-siRNA 組與未轉(zhuǎn)染組，證明了Cofilin-1 表達(dá)受抑制后Huh-7細(xì)胞的遷移能力也受到抑制。本研究應(yīng)用Transwell小室實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Cofilin-1 基因沉默后肝癌細(xì)胞Huh-7 侵襲能力均明顯受到了抑制，Cofilin-1-siRNA組的穿膜細(xì)胞明顯低于Ctrl-siRNA 組與未轉(zhuǎn)染組，提示Cofilin-1 在肝癌侵襲過程中起重要作用。為進(jìn)一步研究Cofilin-1 基因在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

總之，本研究初步發(fā)現(xiàn)Cofilin-1 基因高表達(dá)與肝癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。通過RNA 干擾Cofilin-1基因表達(dá)后，可以在體外抑制肝癌Huh-7 細(xì)胞的遷移和侵襲，提示Cofilin-1 基因參與肝癌轉(zhuǎn)移過程，可能是肝癌基因治療的靶點(diǎn)，而Cofilin-1 基因發(fā)揮其作用的具體分子機(jī)制我們正在進(jìn)一步研究。

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