瘦素受體基因Gln223Arg多態(tài)性與2型糖尿病合并慢性腎功衰竭關(guān)系

李 瑩，孫玉鴻，王英敏，隋洪玉，李雅江，斗 章，高英英，徐 輝＊

（佳木斯大學(xué)1.附屬第一醫(yī)院；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3.《黑龍江醫(yī)藥科學(xué)》編輯部，黑龍江佳木斯154002）

瘦素受體基因Gln223Arg多態(tài)性與2型糖尿病合并慢性腎功衰竭關(guān)系

李 瑩1，孫玉鴻1，王英敏3，隋洪玉2，李雅江1，斗 章1，高英英1，徐 輝2＊

（佳木斯大學(xué)1.附屬第一醫(yī)院；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3.《黑龍江醫(yī)藥科學(xué)》編輯部，黑龍江佳木斯154002）

目的探討瘦素受體基因Gln223Arg多態(tài)性與2型糖尿病合并慢性腎功衰竭關(guān)系。方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)及限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法（PCR－RFLP）分別測(cè)定126例2型糖尿病、108例2型糖尿病合并慢性腎功衰竭和185例對(duì)照組樣本的瘦素受體基因Gln223Arg的基因型，同時(shí)檢測(cè)各組不同基因型樣本的血清瘦素水平。結(jié)果 2型糖尿病合并慢性腎功衰竭組與正常對(duì)照組瘦素受體基因Gln223Arg基因型頻率及等位基因頻率比較差異有顯著性（P＜0.01）。糖尿病組與正常對(duì)照組瘦素受體基因Gln223Arg基因型及等位基因分布頻率差異顯著性（P＜0.05）。2型糖尿病合并慢性腎功衰竭組中GG基因型與AA＋AG基因型血清瘦素水平比較差異有顯著性（P＜0.05）。相同基因型樣本的血清瘦素水平組間比較，任意兩組比較均有差異（P＜0.05）。結(jié)論 瘦素受體基因Gln223Arg多態(tài)性與2型糖尿病合并慢性腎功衰竭相關(guān)。

2型糖尿病；慢性腎功衰竭；瘦素；Gln223Arg；遺傳學(xué)

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1670）

作為一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝性疾病，2型糖尿?。═2DM：Type 2Diabetes Mellitus）近10年來(lái)，發(fā)病率逐年增高，也是一種世界范圍的流行?。?］。我國(guó)DM發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，DM引起腎臟的損害是2型DM患者的主要并發(fā)癥。糖尿病腎病是糖尿病患者死亡的主要原因之一［2］。本研究應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)2型DM及2型DM合并慢性腎功能衰竭患者瘦素（lep）受體基因Gln223Arg的多態(tài)性進(jìn)行分析，旨在探討瘦素系統(tǒng)在糖尿病合并腎功衰竭發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

所有病例來(lái)源于2012年1月至2012年12月在我院腎內(nèi)科、內(nèi)分泌科收住院的2型DM及2型DM合并慢性腎功能衰竭患者，均無(wú)血緣關(guān)系，其中2型DM男性81例，女性45例，平均年齡50.7± 6.2歲；2型DM合并慢性腎功能衰竭患者男性74例，女性34例，平均年齡55.7±3.4歲。對(duì)照組為本院同時(shí)期健康體檢者，平均年齡42.5±2.9歲；經(jīng)臨床體檢及實(shí)驗(yàn)室檢查，排除心、肝、腎、腦等器質(zhì)性病變以及高血壓、糖尿病、各種炎癥、腫瘤以及免疫性疾病，且糖耐量正常者，男性104例，女性81例，平均年齡47.8±3.2歲，其年齡、性別方面均與病例組無(wú)明顯差別（P＞0.05）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

受試者夜間禁食12小時(shí)，晨起抽取外周靜脈血2ml，經(jīng)EDTA抗凝離心得白細(xì)胞，－80℃低溫保存，待用。常規(guī)用苯酚－氯仿法提取外周血白細(xì)胞基因組DNA。參考Richert L［3］等所采用的引物序列，并經(jīng)過(guò)引物設(shè)計(jì)軟件優(yōu)化設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：上游：5’－ACC CTT TAA GCT GGG TGT CCC AAA TGA－3＇，下游：5’－AGC TAG CAA ATA TTT TTG TAA GCA ATT－3＇。PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為416bp，以限制性?xún)?nèi)切酶MspI（New England Biolabs）在37℃酶解PCR產(chǎn)物4h，電泳后觀察結(jié)果。上述采血時(shí)同時(shí)抽取靜脈血3ml，等待血液凝固后通過(guò)離心法提取血清并放置在－70℃低溫冰箱中待檢，最后測(cè)定采用放射免疫分析法進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用Hardy Weinberg遺傳平衡定律確認(rèn)各亞型基因頻率已達(dá)遺傳平衡具有群體代表性。采用SPSS12.0（Statistical Product and Service Solutions）統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用ˉx±s來(lái)表示數(shù)據(jù)，采用F檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)進(jìn)行組內(nèi)比較，當(dāng)P＜0.05時(shí)，表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩個(gè)分類(lèi)變量的關(guān)聯(lián)性分析采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR－RFLP檢測(cè)

紫外透視儀觀察結(jié)果顯示有3種帶型：基因型為AA時(shí)，酶切后為416bp一條帶；GG型酶切后為293bp、123bp兩條帶；AG型酶切后為416bp、293 bp、123bp三條帶（見(jiàn)圖1）。

2.2 基因型分布頻率與瘦素受體等位基因之間的關(guān)系

如表1所示，Gln223Arg的基因型及等位基因分布頻率在糖尿病組與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01，AA＋AG及GG基因型分布頻率正常對(duì)照組與糖尿病合并腎功衰竭組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 糖尿病合并腎功衰竭組、糖尿病組及正常對(duì)照組不同瘦素受體基因型血清瘦素水平比較見(jiàn)表2。

2型糖尿病合并慢性腎功衰竭組，GG基因型與AA＋AG基因型血清瘦素水平比較有差異，t＝2.189，P＝0.031，P＜0.05。2型糖尿病組，GG基因型與AA＋AG基因型血清瘦素水平比較有差異，t＝3.237，P＝0.002，P＜0.01。對(duì)照組，GG基因型與AA＋AG基因型血清瘦素水平比較無(wú)差異，t＝1.477，P＝0.142＞0.05。

2.4 糖尿病合并腎功衰竭組、糖尿病組及正常對(duì)照組，三組相同瘦素受體Gln223Arg基因型血清瘦素（leptin）水平比較見(jiàn)表3。

分別從GG、AA＋AG基因型瘦素水平兩兩比較結(jié)果，三組中的任意兩組比較均有差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 瘦素受體基因Gln223Arg多態(tài)性電泳結(jié)果

表1 Gln223Arg基因型和等位基因頻率分布

表2 瘦素受體Gln223Arg不同基因型血清瘦素（leptin）水平比較（ng／ml，ˉx±s）

表3 三組相同瘦素受體Gln223Arg基因型血清瘦素水平比較（ng／ml，ˉx±s）

3 討論

病程在10－20年的T2DM病人中超過(guò)50%有蛋白尿現(xiàn)象，腎臟發(fā)生腎小球硬化等特異性病理改變，如腎小管空泡變性、腎臟入球和出球小動(dòng)脈硬化等。該病的病程嚴(yán)重程度幾乎與糖尿病病程平行。這種糖尿病患者所特有的腎小球硬化與腎小球病變?cè)卺t(yī)學(xué)上我們稱(chēng)為糖尿病性腎?。?，5］。由于該病患者造成腎功能衰竭者據(jù)國(guó)外有關(guān)資料表明比非糖尿病患者高17倍，是糖尿病患者死亡的主要原因之一［6，7］。經(jīng)國(guó)外多項(xiàng)研究結(jié)果證明肥胖是2型DM發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，尤其是腹型肥胖最為顯著［8］。1994年，Zhang等利用定位克隆技術(shù)首次成功克隆出了小鼠的肥胖基因（ob基因）以及我們?nèi)祟?lèi)的同源基因序列，使人們認(rèn)識(shí)到了瘦素（Leptin，lep）作為ob基因的蛋白產(chǎn)物的化學(xué)分子結(jié)構(gòu)和生理作用［9］，lep是肥胖基因編碼，由脂肪細(xì)胞分泌的前激素蛋白［10］。lep為肥胖基因的蛋白產(chǎn)物，是主要由脂肪組織分泌的激素。最初發(fā)現(xiàn)它具有控制食欲和促進(jìn)能量消耗的作用，lep通過(guò)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)及周?chē)鞴俚氖菟厥荏w直接結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)體內(nèi)的能量平衡、脂肪代謝及某些內(nèi)分泌功能［11］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)它還具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、活化巨噬細(xì)胞、促進(jìn)血管生成、促成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)、膠原合成等功能，與炎癥性結(jié)腸疾病、惡性腫瘤、骨骼疾病、哮喘等疾病有密切關(guān)系［12］。瘦素受體（LEPR）是新近克隆的基因，目前LEPR基因存在多種多態(tài)性，這種多態(tài)性主要由于LEPR基因的核苷酸變異［13］，研究較多的變異有Gln223Arg、Lys109Arg、Lay656Asn等，這些多態(tài)性與肥胖、糖尿病、惡性腫瘤、骨質(zhì)疏松、慢性阻塞性疾病等有一定相關(guān)性［3，14，15］。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)瘦素受體Gln223Arg基因多態(tài)性與2型糖尿病合并慢性腎功衰竭研究甚少。本研究表明：①2型糖尿病合并慢性腎功衰竭患者A、G等位基因分布頻率為0.36和0.64，和2型糖尿病組0.20和0.80及正常對(duì)照組0.14和0.86比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），上述等位基因多態(tài)可能與2型糖尿病合并慢性腎功衰竭有關(guān)。②不同基因型血清瘦素水平比較，2型糖尿病組合并腎功衰竭及2型糖尿病組中，GG基因型與AA＋AG基因型血清瘦素比較均有差異，t＝3.237，P＝0.002，P＜0.05。對(duì)照組GG基因型與AA＋AG基因型無(wú)差異，t＝1.477，P＝0.142 P＞0.05。表明基因多態(tài)與瘦素水平有關(guān)，進(jìn)一步表明A等位基因可能是2型糖尿病及2型糖尿病合并腎功衰竭的易感基因。③對(duì)于相同瘦素受體Gln223Arg基因型檢測(cè)瘦素水平對(duì)比，2型糖尿病合并腎功衰竭、2型糖尿病、正常對(duì)照組間瘦素濃度具有顯著差異（P＜0.05），血清瘦素濃度在2型糖尿病合并腎衰患者顯著高于2型糖尿病患者及正常對(duì)照組，2型糖尿病患者高于對(duì)照組，提示糖尿病患者存在高瘦素血癥，隨著腎臟功能的減低，腎臟清除瘦素能力減低，血清瘦素水平逐漸增高，進(jìn)一步證明腎功能不全時(shí)，腎小球?yàn)V過(guò)功能減低或腎小管降解功能下降，導(dǎo)致腎臟清除瘦素的能力減低，過(guò)高的血清瘦素還會(huì)在腎組織中集聚，進(jìn)一步使腎臟損傷［6］。我們的數(shù)據(jù)表明，瘦素受體基因Gln223Arg多態(tài)性與2型糖尿病合并腎功衰竭的發(fā)生顯著相關(guān)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，瘦素受體Gln223Arg多態(tài)性與2型糖尿病患者及其合并腎功衰竭患者血漿瘦素濃度存在關(guān)聯(lián)。本研究從基因水平初步分析了瘦素受體基因在2型糖尿病合并慢性腎功衰竭的發(fā)生過(guò)程可能發(fā)揮作用，這為今后治療糖尿病腎病提供了新思路。全面分析瘦素受體基因在2型糖尿病合并慢性腎功衰竭發(fā)生的作用機(jī)制，尚需進(jìn)一步的大樣本的研究來(lái)證實(shí)。

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Relationship between polymorphism of leptin receptor gene Gln223Arg and type 2 diabetes mellitus with chronic renal fail－ure

LI Ying，SUN Yu－h(huán)ong，WANG Ying－min，et al.
（First Afficiated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154002，China）

ObjectiveTo investigate the relationship of polymorphism of leptin receptor gene Gln223Arg with type 2diabetes mellitus with chronic renal failure.Methods By using polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism（PCR－RFLP），we respectively measured leptin receptor gene Gln223Arg in 126cases of type 2diabetes mellitus patients，108cases of type 2diabetes mellitus with chronic renal failure and 185patients with control group sample，Simultaneously detected leptin levels in each genotype samples.Results The genotype freguency of Gln223Arg polymorphism in leptin receptor gene had significant difference between 108cases of type 2diabetes mellitus and renal failure with normal control groups，P＜0.01，The genotype freguency of Gln223Arg polymorphism in leptin receptor gene had significant difference between patients with type 2diabetes mellitus without renal failure and controls，P＜0.05.There are significant difference between GG genotype and AA＋AG genotype in type 2diabetes mellitus with chronic renal failure group in serum leptin levels，P＜0.05.Compared with three identical leptin receptor Gln223Arg gene of serum leptin levels，compared results Separately from the GG，AA＋AG genotype of serum leptin levels.Comparison of any two sets，there are significant difference in type 2diabetes mellitus with renal failure，type 2 diabetes without renal failure and normal control group，P＜0.05.Conclusion Gln223Arg polymorphism in leptin receptor gene is associated with type 2diabetes mellitus with chronic renal failure.

type 2diabetes；chronic renal failure；serum leptin；Gln223Arg gene variation；Genetics

R587.1

A

李瑩（1977－），女，黑龍江佳木斯人，副主任醫(yī)師，碩士研究生。

2014－11－25）

1007－4287（2015）10－1670－04

本課題為佳木斯大學(xué)課題（S2009－053）

＊通訊作者