穩(wěn)定表達(dá)miR-17-5p的PC12細(xì)胞株構(gòu)建及鑒定

張皓云, 王魯娟, 王鳳斌, 劉紅兵, 蘇文霞

(1. 濰坊醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)概論教研室, 山東 濰坊 261053; 2. 濰坊醫(yī)學(xué)院 診斷學(xué)教研室, 山東 濰坊 261053;3. 濰坊醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室, 山東 濰坊 261053)

張皓云1, 王魯娟2, 王鳳斌3, 劉紅兵3, 蘇文霞3

(1. 濰坊醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)概論教研室, 山東 濰坊 261053; 2. 濰坊醫(yī)學(xué)院 診斷學(xué)教研室, 山東 濰坊 261053;3. 濰坊醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室, 山東 濰坊 261053)

目的:構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)miR-17-5p 的PC12細(xì)胞株。方法:將質(zhì)粒PEGFP-N1-vector空載體和PEGFP-N1-miR-17-5p表達(dá)載體擴(kuò)增、抽提,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白GFP表達(dá),Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞 miR-17-5p的表達(dá)。結(jié)果:熒光顯微鏡觀察到空載組和miR-17-5p組細(xì)胞都有綠色熒光蛋白高表達(dá),Real-time PCR檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR 17-5p后PC12細(xì)胞內(nèi)miR-17-5p的表達(dá)較空載組明顯升高(P<0.01)。 結(jié)論:miR-17-5p在PC12細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá),為進(jìn)一步研究miR-17-5p對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)制作用提供有用的細(xì)胞模型。

微小RNA； miR-17-5p； PC12細(xì)胞

微小RNA(microRNAs, miRNAs)是細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、增殖、衰老以及凋亡的重要調(diào)節(jié)因子[1],在腦組織中可調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá),廣泛參與神經(jīng)元發(fā)育、細(xì)胞成熟和遷移、突觸可塑性等多種生理過(guò)程,是學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程中重要的調(diào)控因子。越來(lái)越多的研究表明，miRNA的功能異常可能參與了阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的發(fā)生。miR-17-5p是miR-17-92基因簇的一員,已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-17-5p可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期、凋亡、炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答等參與腫瘤的發(fā)生、侵入和轉(zhuǎn)移等[2-3]。目前,有研究顯示miR-17-5p在神經(jīng)組織有特異性表達(dá),但其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)節(jié)作用研究較少,為此我們構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)miR-17-5p的PC12細(xì)胞株,為研究miR-17-5p在神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)制作用構(gòu)建良好的細(xì)胞模型。

1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

PC12細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院)；質(zhì)粒PEGFP-N1-vector空載體(vector)和PEGFP-N1-miR-17-5p(miR-17-5p)表達(dá)載體(加拿大多倫多大學(xué)楊伯華教授饋贈(zèng))；XL-1-blue感受態(tài)菌(濰坊醫(yī)學(xué)院分子免疫實(shí)驗(yàn)室保存)；RPMI-1640培養(yǎng)基(HyClone,賽默飛世爾科技有限公司)、胰蛋白酶(杭州四季青生物材料工程有限公司)；胎牛血清(上海依科賽生物制品有限公司)；D0018質(zhì)粒中量抽提試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Lipofectamine 2000(invitrogen公司)；Hairpin-itTMmiRNAs qPCR Quatitation Assay試劑盒(上海吉瑪公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,37℃、5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔48 h換液,待單層培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合后傳代,選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 質(zhì)粒的擴(kuò)增、抽提

(1) 質(zhì)粒的擴(kuò)增。將紙片上的質(zhì)粒vector(526 μg/mL)和miR-17-5p (266 μg/mL)剪下,加入TE緩沖液(pH8.8)100 μL,4 ℃靜置約2 h,離心1 min,留上清液備用:取100 μL的XL-1-blue感受態(tài)菌,再加入20 μL質(zhì)粒上清液混均；冰浴30 min左右；42 ℃熱擊90 s；置于冰上5 min,加入LB培養(yǎng)基600 μL；37 ℃搖床1 h；離心2 min,棄上清液450 μL,保留沉淀物150 μL備用,接種到已備好的卡那抗性培養(yǎng)基上；第2天挑出單個(gè)菌落加入5 mL卡那LB； 37 ℃搖床過(guò)夜。

(2) 質(zhì)粒抽提。采用碧云天D0018中量抽提試劑盒按說(shuō)明書,抽提質(zhì)粒miR-17-5p。用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)(NanoDrop 2000c,賽默飛世爾科技有限公司)檢測(cè)質(zhì)粒濃度。

2.3 細(xì)胞株的構(gòu)建

(1) 細(xì)胞準(zhǔn)備。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞并接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,待細(xì)胞長(zhǎng)至90%～95%混合時(shí),吸出完全培養(yǎng)基,用RPMI-1640(不含血清)沖洗2～3次,加入適量RPMI-1640(不含血清)。

(2) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選。利用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體,將抽提所得vector、miR-17-5p質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到PC12細(xì)胞中,G418(600 μg/mL)篩選2周,挑取GFP陽(yáng)性單克隆細(xì)胞,以300 μg/mL G418完全培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng),備用。熒光倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。

2.4 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染的綠色熒光蛋白的表達(dá)

將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞傳代,接種入放有10%的多聚賴氨酸處理后蓋玻片的24孔板中,待細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24 h后取出, PBS漂洗3次,4%的多聚甲醛4 ℃固定30 min,取出細(xì)胞爬片,封片,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和綠色熒光蛋白的表達(dá)。

2.5 Real-time PCR檢測(cè) miR-17-5p的表達(dá)

細(xì)胞總 RNA 提取按Trizol說(shuō)明書進(jìn)行,經(jīng)紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢測(cè),A260∶A280值為1.8～2.0(A為吸光度)的用于cDNA合成。采用Hairpin-itTMmiRNAs qPCR Quatitation Assay試劑盒(上海吉瑪公司產(chǎn)品)進(jìn)行 RNA 反轉(zhuǎn)錄、miR-17-5p real-time PCR 擴(kuò)增,具體操作按照說(shuō)明書進(jìn)行。U6 為內(nèi)參照基因。反應(yīng)條件:95 ℃、3 min；95 ℃、12 s,62 ℃、60 s 40個(gè)循環(huán)。根據(jù)相對(duì)定量法計(jì)算目的片段擴(kuò)增比例,各樣本重復(fù)3 次。所得數(shù)據(jù)用 2-ΔΔCt評(píng)定各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株內(nèi) miR-17-5p相對(duì)表達(dá)量。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 vector、miR-17-5p轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞及G418抗性克隆的篩選

用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒vector、miR-17-5p后對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染, 600 μg/mL G418進(jìn)行抗性克隆的篩選。G418的培養(yǎng)液中培養(yǎng)至14 d,未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無(wú)G418抗性，不能貼壁生長(zhǎng),轉(zhuǎn)染后細(xì)胞有細(xì)胞克隆生長(zhǎng)。

3.2 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染的綠色熒光蛋白的表達(dá)

2組細(xì)胞在熒光顯微鏡下均可見(jiàn)到強(qiáng)弱不等的綠色熒光(見(jiàn)圖1),vector組細(xì)胞綠色熒光表達(dá)亮度高,分裂增殖能力強(qiáng),細(xì)胞密度高、輪廓清楚；miR-17-5p組細(xì)胞較vector組綠色熒光表達(dá)稍弱,分裂增殖能力差，細(xì)胞密度低、部分細(xì)胞輪廓不清楚。

圖1 Fluorescent microscopy of vector and miR-17-5p stable transfected PC12 cells (× 100).

3.3 Real-time PCR檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞內(nèi) miR-17-5p的表達(dá)

PC12細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 miR-17-5p表達(dá)載體后,細(xì)胞內(nèi) miR-17-5p的表達(dá)較vector空載組明顯升高(P<0. 01),見(jiàn)圖2。

圖2 The expression of miR-17-5p in stable transfected PC12 cells. Each bar represents the mean±S.E.M. of four independent experiments. **P<0.01, compared with vector.

4 討論

miRNAs是一類長(zhǎng)度為20～25個(gè)核苷酸分子組成的內(nèi)源性非編碼小分子RNA,通過(guò)與靶mRNA分子3’端非編碼區(qū)域( 3’ -untranslated region,3’-UTR) 的完全或不完全配對(duì),降解靶基因mRNA或抑制蛋白合成,從而調(diào)節(jié)靶基因參與的信號(hào)通路,實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、分化、新陳代謝等的調(diào)節(jié)。研究證明，人類60% 以上的蛋白編碼基因表達(dá)受到miRNA 調(diào)控[4]。腦組織中富含miRNA,相對(duì)于其他器官表達(dá)的miRNA種類更多,表達(dá)水平也更高,在正常的神經(jīng)系統(tǒng)中,miRNA參與了不同生理過(guò)程、不同信號(hào)傳導(dǎo)通路的基因表達(dá)調(diào)控,如神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、神經(jīng)元增殖、凋亡、突觸可塑性、樹突棘形成、神經(jīng)保護(hù)及誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化等[5-7],miRNA與大腦的學(xué)習(xí)與記憶功能以及神經(jīng)變性性疾病等都密切相關(guān)[8]。隨著年齡的老化及細(xì)胞分裂的進(jìn)行,機(jī)體miRNA的合成、代謝及功能也有可能會(huì)發(fā)生一系列的變化,而對(duì)這一過(guò)程的深入了解將有助于miRNA在AD等神經(jīng)退行性疾病發(fā)生、發(fā)展的探討。

AD是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、記憶損害為主要表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。研究發(fā)現(xiàn)AD的發(fā)生機(jī)制可能與β淀粉樣蛋白 (β-amyloid protein,Aβ)沉積、Tau蛋白磷酸化、免疫炎癥等病理過(guò)程有關(guān)。miRNA能通過(guò)介導(dǎo)這些病理過(guò)程而參與AD的發(fā)生[9-10]。APP基因的點(diǎn)突變、代謝異常及過(guò)表達(dá)引起的Aβ聚集,APP也是miRNA靶向調(diào)控分子之一,據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)分析,APP mRNA 3’UTR 區(qū)存在多個(gè)miRNA的潛在結(jié)合位點(diǎn),篩選與AD相關(guān)的miRNAs及其靶基因和相應(yīng)的蛋白表達(dá),有望成為研究AD發(fā)病機(jī)制和治療的新途徑。

研究顯示，miR-17-5p在腦組織有特異性表達(dá),參與調(diào)控神經(jīng)元APP基因表達(dá)的過(guò)程,在膠質(zhì)細(xì)胞瘤的研究中發(fā)現(xiàn)miR-17-5p通過(guò)抑制murine double minute 2 (MDM2)基因的表達(dá),抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和降低耐藥性[11-13]。PC12細(xì)胞株源自神經(jīng)嵴細(xì)胞,經(jīng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)處理后,可分化成交感神經(jīng)元樣細(xì)胞,這種分化使其在形態(tài)、生理、生化功能方面更接近于神經(jīng)元。我們利用轉(zhuǎn)基因技術(shù),成功建立了在PC12細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)miR-17-5p的細(xì)胞模型,熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)miR-17-5p組PC12細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、細(xì)胞密度低,提示miR-17-5p對(duì)細(xì)胞的分裂、增殖可能有抑制作用。

我們將深入研究和探討miR-17-5p對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)制作用及其機(jī)制,從新的角度來(lái)研究AD的發(fā)病機(jī)制,從而為其治療提供新的靶點(diǎn)。

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Establishment and appraisal of miR-17-5p stably transfected PC12 cell line

Zhang Haoyun1, Wang Lujuan2, Wang Fengbin3, Liu Hongbing3, Sun Wenxia3

(1. Department of preclinical medicine, Weifang Medical College, Weifang 261053, China; 2. Department of diagnostics, Weifang Medical College, Weifang 261053, China; 3. Department of Physiology, Weifang Medical College, Weifang 261053, China)

Objective: To establish stable expressing miR-17-5p PC12 cell line.Methods: Amplification and extraction of PEGFP-N1-vector and PEGFP-N1-miR-17-5p plasmids. Then the plasmids were transfected into PC12 cells by Lipofectamine 2000. Fluorescence microscope and real-time PCR were employed to detect the expression alterations of GFP and miR-17-5p in stable transfected PC12 cells. Results: High expressions of GFP were observed both in vector group and miR-17-5p group. Real-time PCR show that the expression of miR-17-5p is significantly elevated in PEGFP-N1-miR-17-5p stable transfected PC12 cells compared with the PEGFP-N1-vector stable transfected cells (P<0.01). Conclusion: Stable transfection of miR-17-5p PC12 cell line is established which will provide a useful tool to study the role of miR-17-5p in neurons.

microRNA; miR-17-5p; PC12 cell

2015- 05- 11 修改日期：2015- 06- 23

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZL2013HL065);山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目(J15LK10)

張皓云(1974—)，女，北京，博士，講師，研究方向?yàn)樯窠?jīng)退行性疾病機(jī)制及其防治研究.

E-mail：haoyunzh@163.com

R33-33,Q4-33

B

1002-4956(2015)12- 0066- 03