針刺對腦缺血再灌注模型大鼠ROCK表達(dá)影響的動態(tài)觀察

王穎

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,合肥 230061)

缺血性腦血管病是一類嚴(yán)重危害人類健康的疾病,致死率和致殘率較高,發(fā)病率逐年上升,且有年輕化的趨勢。急性腦梗死的主要治療目標(biāo)是搶救可逆性缺血損害。研究表明,在眾多因素中,治療時機的選擇也是影響缺血損害有效保護的關(guān)鍵因素之一。超過一定的時間界限,缺血損害則變?yōu)椴豢赡?此時無論采取任何治療手段都收效甚微。因此,在治療上出現(xiàn)時間窗概念。Pulsinelli WA等[1]首先提出了治療時間窗,其認(rèn)為在腦缺血發(fā)作后,于一定時間內(nèi)給予積極治療,可減輕腦損傷的程度,促進機能恢復(fù),并改善長期的預(yù)后。這個允許的時間稱為治療時間窗。Rho/ROCK信號通路參與了多種腦梗死危險因素的產(chǎn)生,在腦梗死急性期和亞急性期以及恢復(fù)期過程中均起著重要作用,抑制腦缺血后 ROCK活性已經(jīng)成為治療缺血性腦血管病的新靶點。針刺治療缺血性腦卒中臨床取得比較滿意的療效[2-6],但其對于Rho/ROCK信號的影響及其對下游效應(yīng)因子的調(diào)控作用尚不明確,故筆者通過實驗研究,觀察不同時間針刺治療對 Rho/ROCK信號的影響,明確針刺抑制局灶性缺血性再灌注大鼠 ROCK表達(dá)的最佳時間段,以最大程度保護和改善缺血后的腦組織損傷,為臨床選擇最佳時間應(yīng)用針刺治療缺血性腦血管病提供新的實驗證據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選取180只成年Wista雄性大鼠(安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供),體重(250±30)g,鼠齡為12 w,隨機分為空白組、假手術(shù)組、模型組和針刺組,模型組和針刺組又分為6 h、24 h、48 h、72 h和2 w5個亞組,共12組,每組15只。

1.2 實驗試劑及儀器

RIPA細(xì)胞裂解液及BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所提供);SDS(德國Serva公司);甘氨酸(美國AMRESCO公司);TEMED與Tris堿(美國Sigma公司);PVDF膜(美國Millipore公司);超薄切片機(瑞典LKB-V型);過硫酸氨、丙烯酰胺(美國Sigma公司);電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(美國 Pierce公司);甲醇購于上海中試化工總公司;丙烯酰胺(Fluka公司);甲叉雙丙烯酰胺(美國 AMRESCO公司抗體);Rock1(美國Proteintech公司,編號 21850-1-AP);Actin(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,編號 TA-09);二抗分別為山羊抗小鼠 IgG(編號 ZB2305)和山羊抗兔 IgG(編號ZB2301)。

AF-10型自動制冰機(意大利 SCOTSMAN);EPS300型電泳儀、VE-180型電泳槽和 VE-186型轉(zhuǎn)膜儀(Tanon);LX300型微量離心機(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);JW-3021HR高速臺式冷凍離心機(安徽嘉文儀器裝備有限公司);微量移液器(德國Eppendorf);針灸針(蘇州天協(xié)針灸器械有限公司);魚線(安徽太平洋漁具有限公司)。

1.3 造模方法

使用線栓法阻塞大鼠右側(cè)大腦中動脈復(fù)制局灶性腦缺血模型,術(shù)后大鼠出現(xiàn)左側(cè)偏癱,提尾懸拉時出現(xiàn)左上肢蜷縮屈曲或被動性過度伸展,同時出現(xiàn)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈、跌倒,即可納入實驗。

1.4 模型評估

神經(jīng)功能缺失評估與死亡率分別于建模前、麻醉清醒后及術(shù)后對所有實驗大鼠參考Longa EZ等[7]的方法進行神經(jīng)功能缺失評估,其中每個時間點每組各取5只大鼠評分結(jié)果進行統(tǒng)計分析。0分為無神經(jīng)功能缺失;1分為左側(cè)前肢內(nèi)收、屈曲;2分為自主運動時身體向左側(cè)劃圈;3分為身體向左側(cè)傾倒;4分為不能自主行走并伴有意識障礙。1分以上收入實驗分組,觀察期內(nèi)死亡動物剔除并予以補足。

1.5 處理方法

所有大鼠給予普通飲食,假手術(shù)組僅作頸動脈分離,空白組和假手術(shù)組于造模后第2天取材檢測,模型組中各小組分別于造模后6 h、24 h、48 h、72 h和2 w取材檢測。

針刺組分別于再灌注后 6 h、24 h、48 h、72 h和2 w進行針刺。取百會、大椎、足三里。大鼠百會穴位于頂骨正中;大椎穴定位第7頸椎與第1胸椎間,背部正中;足三里穴定位在膝關(guān)節(jié)后外側(cè),在腓骨小頭下約 5 mm處。采用 0.35 mm×13 mm毫針刺入穴位,進針后輕度捻轉(zhuǎn),以局部輕顫為度,留針 30 min,期間每15 min行針1次。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 神經(jīng)行為學(xué)評估

各組大鼠經(jīng)各自處理后,對其進行神經(jīng)行為學(xué)評估,依然參考Longa EZ等[7]的方法。

1.6.2 免疫組織化學(xué)檢測

①組織勻漿及蛋白的提取;②電泳;③轉(zhuǎn)膜;④封閉;⑤一抗孵育;⑥二抗孵育;⑦蛋白檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,以析因設(shè)計的方差分析作差異的顯著性分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型組和針刺組大鼠缺血再灌注各時間點神經(jīng)功能評分比較

由表1、圖1可見,模型組大鼠缺血再灌注各時間點神經(jīng)功能評分與針刺組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。針刺組再灌注6 h的神經(jīng)功能評分與同組其他再灌注時間比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 各組不同時間段ROCK表達(dá)比較

由表2及圖2、圖3可見,模型組(缺血再灌注6 h、24 h、48 h、72 h)ROCK表達(dá)與空白組比較,均顯著上調(diào)(P＜0.05),其中6 h ROCK表達(dá)達(dá)到峰值。針刺組(缺血再灌注6 h、24 h、48 h)ROCK表達(dá)與模型組(缺血再灌注 6 h、24 h、48 h)點對點比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01,P＜0.05),其中針刺缺血再灌注6 h組ROCK下調(diào)最為顯著。而針刺組(缺血再灌注72 h、2 w)ROCK表達(dá)與模型組(缺血再灌注72 h、2 w)比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 針刺組與模型組神經(jīng)功能缺損評分與ROCK表達(dá)相關(guān)性分析

由圖 4可見,針刺 6 h組腦缺血再灌注模型大鼠ROCK表達(dá)下調(diào)最為顯著,與針刺組(24 h、48 h、72 h)比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。同時針刺6 h組神經(jīng)功能評分下調(diào)幅度最大,與針刺組(24 h、48 h、72 h)比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 模型組和針刺組大鼠缺血再灌注各時間點神經(jīng)功能評分比較 (±s,分)

表1 模型組和針刺組大鼠缺血再灌注各時間點神經(jīng)功能評分比較 (±s,分)

注:與模型組比較1)P＜0.05;與同組再灌注6 h比較2)P＜0.05

組別 n 再灌注6 h 再灌注24 h 再灌注48 h 再灌注72 h 再灌注2 w模型組 75 3.20±0.41 2.60±0.51 2.00±0.65 1.40±0.51 0.80±0.41針刺組 75 2.80±0.411) 2.20±0.411)2) 1.60±0.511)2) 1.00±0.651)2) 0.60±0.511)2)

表2 各組大鼠缺血再灌注各時間點ROCK表達(dá)活性比較 (±s)

表2 各組大鼠缺血再灌注各時間點ROCK表達(dá)活性比較 (±s)

注:與模型組比較1)P＜0.01,2)P＜0.05;與同組再灌注6 h比較3)P＜0.05;與空白組比較4)P＜0.05;與假手術(shù)組比較5)P＜0.05

組別 n 再灌注6 h 再灌注24 h 再灌注48 h 再灌注72 h 再灌注2 w空白組 15 1.31±0.02 - - - -假手術(shù)組 15 1.32±0.02 - - - -模型組 75 2.96±0.014)5) 2.81±0.014)5) 2.71±0.014)5) 2.62±0.014)5) 1.47±0.02針刺組 75 1.77±0.021) 1.98±0.022)3) 2.19±0.022)3) 2.57±0.013) 1.47±0.013)

圖1 模型組和針刺組大鼠腦缺血再灌注各時間點神經(jīng)功能評分

圖2 模型組不同時間ROCK表達(dá)比較

圖3 針刺組不同時間ROCK表達(dá)比較

圖4 兩組神經(jīng)功能缺損評分與ROCK表達(dá)相關(guān)性分析

4 討論

Rho/ROCK通路是人和動物體內(nèi)普遍存在的一條信號傳導(dǎo)通路,它參與多種生物學(xué)行為,包括細(xì)胞增殖與凋亡、調(diào)控細(xì)胞形態(tài)維持、細(xì)胞粘附與遷移等[8-9]。近些年來,關(guān)于ROCK抑制劑進行了大量的動物試驗及臨床研究,也證實了ROCK活性與缺血性腦卒中的密切關(guān)系[10]。它在保護皮型一氧化氮合酶的活性、修復(fù)神經(jīng)損傷、抑制炎癥反應(yīng)、防治動脈粥樣硬化等具有顯著的優(yōu)勢[11-15]。Yagita Y等[16]發(fā)現(xiàn)抑制內(nèi)皮細(xì)胞ROCK表達(dá),可以阻止卒中后腦梗死體積的擴大,改善神經(jīng)功能。Satoh S等[17]研究發(fā)現(xiàn),ROCK抑制劑鹽酸法舒地爾通過降低血液黏稠度并阻止腦組織內(nèi)中性粒細(xì)胞的聚集,減少梗死體積,促進神經(jīng)功能恢復(fù)。由此可見,抑制ROCK表達(dá)對于缺血性腦卒中患者神經(jīng)功能恢復(fù)具有重要意義。本實驗主要精選百會、大椎、后三里等穴位對局灶性腦缺血再灌注模型大鼠進行針刺,動態(tài)觀察模型大鼠ROCK的變化,確定最佳針刺時間點。百會為督脈要穴,又稱三陽五會,入絡(luò)于腦,有通督調(diào)神之功?！镀諠健?“凡忽中風(fēng),言語謇澀,半身不遂……穴百會,耳前發(fā)際,……神效。”大椎為諸陽之會,是手足三陽經(jīng)與督脈交會穴,具有宣通諸陽之氣而通督活絡(luò)之效?！缎妈T銅人腧穴針灸圖經(jīng)》:“手足三陽、督脈之會?！弊闳餅樽汴柮鹘?jīng)合穴,以調(diào)和經(jīng)脈、疏通氣血,還可健脾胃以運化水濕和水谷精微。三穴合用可奏通督調(diào)神、行氣活血之功。神經(jīng)功能缺損評分結(jié)果顯示,針刺組(6 h、24 h、48 h、72 h)與模型組點對點比較均具有顯著差異(P＜0.05),說明針刺可以有效改善模型大鼠的神經(jīng)功能缺損狀況,促進其神經(jīng)功能的恢復(fù)。其中,針刺6 h組神經(jīng)功能缺損評分下調(diào)幅度最大,與針刺24 h、48 h、72 h組相比具有顯著差異(P＜0.05);觀察不同時間點針刺對局灶性腦缺血大鼠ROCK的表達(dá)的影響,結(jié)果顯示,假手術(shù)組與空白組ROCK表達(dá)相比較沒有顯著差異(P＞0.05);模型組(缺血再灌注6 h、24 h、48 h、72 h)與空白組相比較ROCK表達(dá)均顯著上調(diào)(P＜0.05),2 w組與空白組相比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。其中,缺血再灌注 6 h ROCK上調(diào)達(dá)到峰值。針刺組(6 h、24 h、48 h)ROCK表達(dá)與模型組(缺血再灌注 6 h、24 h、48 h)點對點比較具有顯著差異(P＜0.05)。其中,缺血再灌注 6 h針刺組 ROCK下調(diào)最為顯著,而針刺組(72 h、2 w組)ROCK表達(dá)與模型組(72 h、2 w組)比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。由此可見,ROCK表達(dá)與腦缺血再灌注損傷有著密切的聯(lián)系,在大鼠腦缺血再灌注的不同時間點ROCK表達(dá)呈現(xiàn)一個動態(tài)演變的過程。其中,腦缺血再灌注6 h ROCK上調(diào)最為顯著,隨著時間的推移ROCK表達(dá)呈現(xiàn)下降的趨勢,直到缺血再灌注2 w與正?？瞻捉M趨向一致。而針刺的介入對于腦缺血再灌注大鼠ROCK的調(diào)節(jié)也呈現(xiàn)一個動態(tài)演變的過程,腦缺血再灌注6 h后針刺對ROCK下調(diào)最為顯著,隨后ROCK表達(dá)呈現(xiàn)下降的趨勢,直到缺血再灌注2 w針刺組與正?？瞻捉M趨向一致。而腦缺血再灌注6 h恰為缺血性腦血管病的超級性期,本實驗證明針刺對于超級性期缺血性腦血管病大鼠ROCK的下調(diào)具有顯著意義,可以更大程度保護和改善神經(jīng)功能,這為臨床尋找缺血性腦血管病最佳治療時間點提供了可靠的實驗證據(jù)。同時也為腦缺血治療提供新的靶點。

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