電針合谷穴對(duì)實(shí)驗(yàn)性牙髓痛大鼠三叉神經(jīng)節(jié)P2X2、P2X3受體的影響

陳莉,張英,嚴(yán)琴,樂(lè)凱

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué),武漢 430065;2.江漢大學(xué),武漢 430056)

牙髓痛為口腔疾患中常見(jiàn)的癥狀之一,可見(jiàn)于西醫(yī)學(xué)的齲齒、牙髓炎、根尖周?chē)缀脱辣举|(zhì)過(guò)敏等。中醫(yī)學(xué)稱(chēng)之為“骨槽風(fēng)”“牙咬痛”“牙宣”。針刺合谷穴對(duì)牙髓痛具有良好的鎮(zhèn)痛作用[1-3],但其作用機(jī)理尚未明確。

三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)不僅是細(xì)胞內(nèi)最重要的能量分子,也是組織細(xì)胞間信息傳遞的信號(hào)分子[4]。疼痛、傷害性刺激使損傷細(xì)胞和應(yīng)激細(xì)胞釋放大量ATP,引起P2X受體興奮激活,誘發(fā)動(dòng)作電位沿著神經(jīng)軸突向中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳遞,產(chǎn)生痛覺(jué)[5]。有研究[6-8]表明,ATP及其作用的受體特別是P2X2和P2X3受體參與了傷害性信息的傳遞。

電針合谷穴治療牙髓痛的作用與 P2X2、P2X3受體的關(guān)系目前還不明確。本實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌內(nèi)毒素(LPS)誘導(dǎo)的牙髓痛大鼠為研究對(duì)象,采用RT-PCR檢測(cè)三叉神經(jīng)節(jié)P2X2、P2X3受體mRNA的表達(dá)量,以探索電針合谷穴治療牙髓痛的可能機(jī)制,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

42只健康成年雄性SD大鼠,體重為180～250 g,均牙體、牙列完整,無(wú)齲壞、牙齒畸形及牙周病,咬合正常,由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[許可證號(hào)SCXK(鄂)2008-0004]。

隨機(jī)分為正常組(N組)、對(duì)照組(C組)、牙髓痛組(M組)、拮抗劑組(A組)、電針組(E組)和拮抗劑+電針組(AE組),每組7只。

1.2 主要藥品與儀器

微量移液器(德國(guó)Eppendorf公司),Realtime PCR儀(美國(guó)ABI公司),冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司),大腸桿菌內(nèi)毒素(上海禾豐制藥,生產(chǎn)批號(hào)120801),A-317491(美國(guó)Sigma公司),Trizol(美國(guó)Invitrogen公司),氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇(滬試公司),PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(日本TAKARA公司),β-actin引物(上海生工公司),P2X3引物(上海生工公司)。

1.3 動(dòng)物造模及治療方法

1.3.1 N組

不做任何處理。

1.3.2 C組

在鉆好的牙髓腔內(nèi)注入與 M組等量的生理鹽水,浸潤(rùn)5～6 min后用牙科填料將牙洞封閉。

1.3.3 M組

用小型電鉆或手鉆(鉆頭直徑約1 mm)在上頜一側(cè)第一和第二磨牙上鉆孔,深入牙髓腔并暴露牙髓,用微量注射器注入濃度為 5 μg/μL的LPS溶液(每孔注入約1～3 μL), 浸潤(rùn)5～6 min后用牙科填料將牙洞封閉[9]。

1.3.4 A組

同 M組造模后,在注射器注入 LPS溶液時(shí),將A-317491(0.5 mg/kg)同時(shí)注射進(jìn)牙髓。

1.3.5 E組

取雙側(cè)合谷穴[10]。針刺后接電針治療儀,選連續(xù)波,頻率為2 Hz,強(qiáng)度為1 mA,留針30 min。每日1次,共治療3次。

1.3.6 AE組

同M組造模后,采用拮抗劑配合電針治療。拮抗劑治療同A租,電針治療同E組。

1.4 樣本采集

大鼠腹腔注射 10%的水合氯醛麻醉后斷頸處死,立即取出三叉神經(jīng)節(jié)。

1.5 行為學(xué)分析

觀察每組大鼠開(kāi)始治療第1天至最后1天的體重變化及外觀變化。觀察每組造模后30 min行為學(xué)變化,包括大鼠身體和頭部梳理、挖掘和探究、直立動(dòng)作。

1.6 RT-PCR檢測(cè)三叉神經(jīng)節(jié)P2X2、P2X3受體mRNA表達(dá)

1.6.1 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

采用 Trizol RNA提取試劑盒提取三叉神經(jīng)節(jié)總RNA。將 4 μL 5×RT Buffer、2 μL dNTP、1 μL Oliga(dT)18、1 μL RNase Inhibitor、1 μL ReverTra Ace和1 μg RNA加RNase free H2O調(diào)至20 μL。42℃ 20 min,將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;95℃ 5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶后－20℃保存。

1.6.2 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)P2X2、P2X3的mRNA

采用 SYBR Green熒光染料法針對(duì) P2X2、P2X3的 mRNA進(jìn)行實(shí)時(shí) RT-PCR檢測(cè),吸取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物10 μL引物上下游各2 μL,加緩沖液10 μL、ddH2O 4 μL以及 SYBR Green熒光染料 1 μL,放入熒光定量PCR儀,50℃持續(xù) 2 min,接著 95℃持續(xù) 10 min,然后95℃持續(xù)15 s;退火1 min后,95℃持續(xù)15 s,然后60℃持續(xù)15 s,最后95℃持續(xù)15 s。如上進(jìn)行45個(gè)循環(huán),經(jīng)4℃延伸10 min。設(shè)置陰性對(duì)照和β-actin內(nèi)參照。對(duì)P2X2、P2X3受體CT值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,得到各組P2X2、P2X3受體mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組兩兩比較用單因素方差(One-Way ANOVA)分析,組間析因分析用LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)及體重變化情況

正常大鼠皮毛光潤(rùn),行動(dòng)自如,體重穩(wěn)定增長(zhǎng)。LPS造模后,大鼠皮毛萎縮無(wú)光澤,行動(dòng)遲緩,并有跛足現(xiàn)象出現(xiàn),體重增加不明顯。觀察注射后30 min大鼠的行為變化可以發(fā)現(xiàn),造模大鼠身體和頭部梳理、挖掘和探究、直立動(dòng)作次數(shù)明顯增多,各組大鼠行為學(xué)及體重變化情況見(jiàn)表1、2。

由表1、2可見(jiàn),M組、A組、E組和AE組行為學(xué)變化均顯著高于C組和N組(P＜0.01);A組、E組和AE組行為學(xué)變化均顯著低于M組(P＜0.01)。

表1 各組大鼠行為學(xué)變化比較

由表2可見(jiàn),C組體重顯著低于N組(P＜0.01);M組、A組、E組和AE組體重均顯著低于C組和N組(P＜0.01);E組、AE組體重均顯著高于 M組和 A組(P＜0.01,P＜0.05);A組體重稍高于M組(P＜0.05);AE組體重顯著高于E組(P＜0.01)。

表2 各組大鼠體重變化比較 (±s,g)

表2 各組大鼠體重變化比較 (±s,g)

注:與N組比較1)P＜0.01;與C組比較2)P＜0.01;與M組比較3)P＜0.01,4)P＜0.05;與A組比較5)P＜0.01,6)P＜0.05,與E組比較7)P＜0.01

組別 n 體重差值N組 7 15.43±2.55 C組 7 13.45±2.691)M組 7 4.61±3.6971)2)A組 7 6.50±2.321)2)4)E組 7 7.39±2.751)2)3)6)AE組 7 8.81±3.741)2)3)5)7)

2.2 各組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)P2X2、P2X3受體mRNA表達(dá)比較

由表3可見(jiàn),M組、A組和E組P2X3受體mRNA表達(dá)量均高于C組(P＜0.05),且顯著高于N組(P＜0.01);A組、E組和AE組P2X3受體mRNA表達(dá)量顯著低于M組(P＜0.01);AE組P2X3受體mRNA表達(dá)量明顯低于E組(P＜0.01);A組 P2X3受體 mRNA表達(dá)量低于 E組(P＞0.05);AE組P2X3受體mRNA表達(dá)量稍高于C組及N組(P＞0.05)。

表3 各組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)P2X3受體mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

表3 各組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)P2X3受體mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

注:與N組比較1)P＜0.01;與C組比較2)P＜0.05;與M組比較3)P＜0.01;與E組比較4)P＜0.01

組別 n P2X3受體mRNA相對(duì)表達(dá)量N組 7 0.497014±0.079862 C組 7 0.509174±0.071955 M組 7 1.269092±0.0930731)2)A組 7 0.711712±0.0686031)2)3)E組 7 0.802410±0.0530001)2)3)AE組 7 0.603285±0.0660743)4)

表4 各組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)P2X2受體mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

表4 各組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)P2X2受體mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

注:與N組比較1)P＜0.01;與C組比較2)P＜0.01;與M組比較3)P＜0.05;與A組比較4)P＜0.05;與E組比較5)P＜0.05

組別 n P2X2受體mRNA相對(duì)表達(dá)量N組 7 0.091889±0.001779 C組 7 0.087914±0.006766 M組 7 0.150695±0.0034681)2)A組 7 0.126364±0.0066581)2)3)E組 7 0.136770±0.0038441)2)3)4)AE組 7 0.123643±0.0050381)2)3)5)

由表4可見(jiàn),M組、A組、E組和AE組P2X2受體mRNA表達(dá)量均顯著高于N組和C組(P＜0.01);A組、E組和AE組P2X2受體mRNA表達(dá)量低于M組(P＜0.05);A組P2X2受體 mRNA表達(dá)量低于 E組(P＜0.05);E組 P2X2受體mRNA表達(dá)量高于AE組(P＜0.05)。

3 討論

ATP作為一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)從感覺(jué)神經(jīng)末梢釋放,與傷害感受器上一些表達(dá)疼痛的分子結(jié)合從而參與疼痛的信息傳遞[11]。研究表明,P2X受體活化是ATP參與疼痛的機(jī)制,作用于疼痛的發(fā)生和發(fā)展[12-13]。P2X作為配體門(mén)控非選擇性陽(yáng)離子通道受體[14]有7種亞型(P2X1-7),其中 P2X3受體在疼痛信息的傳遞起重要作用[15-17]。當(dāng)疼痛、傷害性剌激引發(fā)細(xì)胞以及感覺(jué)神經(jīng)末梢的ATP大量釋放,引起P2X3受體激活和興奮,進(jìn)而誘發(fā)動(dòng)作電位沿著神經(jīng)系統(tǒng)傳遞,產(chǎn)生疼痛。有研究[3-5]證實(shí),ATP及其作用的受體特別是P2X2和P2X3受體參與了傷害性信息的傳遞。牙髓痛是由牙髓的神經(jīng)末梢傳導(dǎo)至外周感受器三叉神經(jīng)節(jié)的感受神經(jīng)元,經(jīng)收集后傳入下一級(jí)神經(jīng)元,最后到中樞相應(yīng)部位,由大腦皮層作出痛反應(yīng)。P2X3受體在三叉神經(jīng)節(jié)高表達(dá),尤其是選擇性地表達(dá)在中、小細(xì)胞上[18]。P2X2、P2X3受體高選擇性地表達(dá)于中、小直徑三叉神經(jīng)元中[19]。

LPS注射制備的炎性牙髓痛模型具有一定優(yōu)勢(shì)[9]。大鼠注入LPS到牙髓腔后使外周傷害性感受器敏感性增強(qiáng),繼而神經(jīng)末梢的ATP大量釋放,引起P2X3受體激活和興奮,誘發(fā)動(dòng)作電位沿著神經(jīng)系統(tǒng)傳入三叉神經(jīng)節(jié)和中樞神經(jīng)系統(tǒng),從而產(chǎn)生痛覺(jué)。A-317491是 P2X3受體特異性拮抗劑,它的應(yīng)用也可推斷 ATP和P2X3受體與牙髓痛的傳遞有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,M組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)P2X2、P2X3受體mRNA表達(dá)量均顯著高于C組(P＜0.01)。A組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)P2X2受體和P2X3受體mRNA表達(dá)量均低于M組(P＜0.05,P＜0.01),這和其他研究者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[20]一致,說(shuō)明A-317491作為P2X3受體的特異性拮抗劑,可抑制 P2X3受體的表達(dá),可推斷 A-317491對(duì) P2X2受體有一定的拮抗作用,證實(shí)P2X2、P2X3受體參與牙髓痛的痛覺(jué)的形成與傳遞。

合谷是手陽(yáng)明大腸經(jīng)的原穴,出自《靈樞·本輸》,善治頭面、五官疾患,是針灸臨床治療牙痛的效穴[21-22]。針刺合谷穴治療牙髓痛可能就是通過(guò)激活腦區(qū)而發(fā)揮作用[23],通過(guò)刺激中央后回中下部感覺(jué)區(qū)、中央前回下部運(yùn)動(dòng)區(qū)、第二感覺(jué)運(yùn)動(dòng)區(qū)、小腦及錐體外系等多個(gè)腦區(qū),并且誘導(dǎo)顳葉腦組織血流量和血流容積的增加發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。針刺鎮(zhèn)痛與ATP、P2X受體之間的關(guān)系也開(kāi)始被關(guān)注[24]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,E組三叉神經(jīng)節(jié)P2X2受體和P2X3受體mRNA表達(dá)量均低于M組(P＜0.05,P＜0.01),提示電針合谷穴可能通過(guò)抑制 P2X2、P2X3受體的表達(dá)起到有效的鎮(zhèn)痛作用。A組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)P2X2受體mRNA表達(dá)量低于E組(P＜0.05),提示A組在抑制P2X2受體的表達(dá)優(yōu)于E組;而A組在抑制P2X3受體的表達(dá)雖低于 E組,但兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),推斷兩組在抑制P2X3受體表達(dá)的作用相仿。

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推斷在拮抗劑與電針合谷對(duì)P2X2、P2X3受體起抑制作用的前提下,拮抗劑與電針合谷在抑制 P2X3受體作用大概一致,拮抗劑在抑制 P2X2受體優(yōu)于電針合谷,這可能與局部使用A-317491可阻斷由ɑ,β-亞甲基三磷酸腺苷及P2X激動(dòng)劑誘導(dǎo)的傳入神經(jīng)活化和機(jī)械致敏反應(yīng)有關(guān),它作為一種外周作用嘌呤受體阻滯劑,能有效阻斷 P2X2、P2X3受體介導(dǎo)的ATP炎性機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏反應(yīng)[25],因而拮抗劑對(duì) P2X2有較好的抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,AE組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)P2X2受體和 P2X3受體 mRNA表達(dá)量均低于 M組(P＜0.05,P＜0.01),提示拮抗劑配合電針能有效抑制P2X2、P2X3受體。AE組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)P2X2受體和P2X3受體mRNA表達(dá)量均低于E組(P＜0.05, P＜0.01),推測(cè)拮抗劑配合電針抑制P2X2、P2X3受體優(yōu)于單純電針治療。而AE組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)P2X3受體mRNA表達(dá)稍高于N組和C組(P＞0.05),推斷拮抗劑配合電針在抑制P2X3受體表達(dá)顯示出拮抗劑與電針的協(xié)同優(yōu)勢(shì)。

綜上所述,P2X2、P2X3受體參與了實(shí)驗(yàn)性牙髓痛的產(chǎn)生與傳導(dǎo),電針對(duì)牙髓痛的鎮(zhèn)痛作用與 P2X2、P2X3受體參與密切相關(guān),這可能是電針合谷穴鎮(zhèn)痛的機(jī)制之一,電針合谷穴如何調(diào)節(jié) P2X3受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)還有待進(jìn)一步研究。

[1]王兵,張翠英,張軍岐,等.針刺合谷穴治療牙痛的臨床研究[J].上海針灸雜志,2006,25(8):6-9.

[2]賈婕楠.合谷穴配合中成藥治療牙痛 86例[J].針灸臨床雜志,2006,22(3):40.

[3]楊振杰,吳富東,譚奇紋.“面口合谷收”在針灸臨床的運(yùn)用[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011,35(6):566-569.

[4]Ralevic V, Burnstock G. Receptors for purines and pyrimidines[J].Pharmacol Rev, 1998,50(3):413-422.

[5]Wismer CT, Faltynek CR, Jarvis MF, et al. Distinct neurochemical mechanisms are activated following administration of different P2X receptor agonists into the hindpaw of a rat[J]. Brain Res,2003,965(1-2):187-193.

[6]Wang Y, Li G, Liang S, et al. Role of P2X3 receptor in myocardial ischemia injury and nociceptive sensory transmission[J]. Auton Neurosci,2008,139(1-2):30-37.

[7]Zhang C, Li G, Liang S, et al. Myocardial ischemic nociceptive signaling mediated by P2X3 receptor in rat stellate ganglion neurons[J]. Brain Res Bull, 2008,75(1):77-82.

[8]李桂林,梁尚棟,徐昌水,等.頸上交感神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 P2X3受體介導(dǎo)心肌痛傷害性信息作用的電生理研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2007,23(2):193-198.

[9]顧斌,劉洪臣,郭宏,等.大鼠急性牙髓炎動(dòng)物模型的建立[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志,2009,7(5):304-307.

[10]李忠仁.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].第 2版,北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2007:256.

[11]Donnelly-Roberts D, McGaraughty S, Shieh CC, et a1. Painful purinergic receptors[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2008,324(2):409-415.

[12]Ohnishi T, Matsumura S, Ito S. Translocation of neuronal nitric oxide synthase to the plasma membrane by ATP is mediated by P2X and P2Y receptors[J]. Mol Pain, 2009,5:40.

[13]劉曉紅,阮懷珍.ATP、P2X受體在痛覺(jué)調(diào)制中的作用及其與其它遞質(zhì)、受體的相互關(guān)系[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2008,24(4):436-438.

[14]Burnstock G. Physiology and pathophysiology of purinergic neurotransmission[J]. Physiol Rev, 2007,87(2):659-797.

[15]Kuroda H, Shibukawa Y, Soya M, et al. Expression of P2X1and P2X4receptors in rat trigeminal ganglion neurons[J]. Neuroreport, 2012,23(13):752-756.

[16]Gunosewoyo H, Kassiou M. P2X purinergic receptor ligands: recently patented compounds[J]. Expert Opin Ther Pat, 2010,20(5):625-646.

[17]Jarvis MF. The neural-glial purinergic receptor ensemble in chronic pain states[J]. Trends Neurosci, 2010,33(1):48-57.

[18]Xiang Z, Bo X, Burnstock G. Localization of ATP-gated P2X receptor immunoreactivity in rat sensory and sympathetic ganglia[J].Neuorsci Lett, 1998,256(2):105-108.

[19]Shinoda M, Kawahima K, Ozaki N, et a1. P2X3 receptor mediates heat hyperalgesia in a rat model of trigeminal neuropathic pain[J]. J Pain, 2007,8(7):588-597.

[20]Jarvis MF, Burgard EC, McGaranghty S, et al. A-317491, a novel potent and selective non-nucleotide antagonist of P2X3 and P2X2/3 receptors, reduces chronic inflammatory and neuropathic pain in the rat[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002,99(26):17179-17184.

[21]蔡定均,劉旭光,趙征宇,等.合谷穴的主治病癥研究思路[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011,34(1):5-6.

[22]韓健勇,尤艷利.淺談合谷穴臨床鎮(zhèn)痛作用[J].針灸臨床雜志,2011, 27(1):70-72.

[23]李落意,趙斌,楊駿,等.“面口合谷收”神經(jīng)生理機(jī)制的 fMRI研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合影像學(xué)雜志,2012,10(1):13-22.

[24]聶坤.P2X受體、ATP和針刺的信號(hào)轉(zhuǎn)換[J].上海針灸雜志,2009,28(5):298-300.

[25]Wu G, Whiteside GT, Lee G, et al. A-317491, a selective P2X3/P2X2/3 receptor antagonist, reverses inflammatory mechanical hyperalgesia through action at peripheral receptors in rats[J]. Eur J Pharmacol, 2004,504(1-2):45-53.