甘蔗渣、啤酒糟培養(yǎng)靈芝研究和成分分析

黃清鏵,王慶福,高裕鋒,李奇?zhèn)?李錦榮,孟 飛,梁 磊,*

(1.廣州甘蔗糖業(yè)研究所,廣東廣州 510316;2.廣東省植物纖維綜合利用工程技術(shù)研究開發(fā)中心,廣東廣州 510316;3.廣州市植物纖維綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510316)

甘蔗渣、啤酒糟培養(yǎng)靈芝研究和成分分析

黃清鏵1,2,3,王慶福1,2,3,高裕鋒1,李奇?zhèn)?,2,3,李錦榮1,2,3,孟 飛1,2,3,梁 磊1,2,3,*

(1.廣州甘蔗糖業(yè)研究所,廣東廣州 510316;2.廣東省植物纖維綜合利用工程技術(shù)研究開發(fā)中心,廣東廣州 510316;3.廣州市植物纖維綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510316)

通過研究4個供試靈芝菌株生長速度、爬壁能力、菌絲密度和氣生菌絲量等性狀,篩選出最佳的靈芝母種培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蔗渣粉20 g,蛋白胨3 g,磷酸二氫鉀3 g,硫酸鎂1.5 g,維生素B20.1 g;通過比較4個菌株在不同栽培基質(zhì)上子實(shí)體干重、子實(shí)體厚度和子實(shí)體直徑篩選到最適靈芝栽培配方為甘蔗渣82%、啤酒糟15%、石灰粉2%、糖1%;椴木栽培靈芝和蔗渣栽培的靈芝之間總?cè)坪坎町惒淮?其中4個供試靈芝總?cè)坪烤哂?0 mg/g;實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蔗渣栽培的靈芝子實(shí)體中多糖含量是椴木栽培靈芝的兩倍以上;重金屬檢測結(jié)果顯示蔗渣栽培靈芝主要重金屬元素含量低于椴木靈芝,但微量元素Mg、Zn、Se等含量較高,其中有機(jī)硒含量為0.189 mg/g。

甘蔗渣,啤酒糟,靈芝,重金屬

靈芝又名靈芝草、萬年蕈等,屬多孔菌科,靈芝屬,是我國最著名的藥食兩用真菌,因其具有增強(qiáng)人體免疫力[1],調(diào)節(jié)血糖血壓[2],抗腫瘤[3]和保肝護(hù)肝[4]等多方面的治療作用,被世人所青睞。目前研究發(fā)現(xiàn)的靈芝有效成分包括三萜類化合物、多糖類、腺苷以及其他一些生物堿化合物。

甘蔗渣為甘蔗壓榨機(jī)械提汁后的主要產(chǎn)物,是制糖工業(yè)的主要副產(chǎn)品。甘蔗渣含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),其中,纖維素為 32%～48%、半纖維素 19%～24%、木質(zhì)素23%～32%[5]。甘蔗渣來源集中,產(chǎn)量大,是一種再生性農(nóng)林生物質(zhì)資源,目前已在杏鮑菇[6]、平菇[7]和金針菇[8]等食藥用菌的生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用,但應(yīng)用蔗渣栽培靈芝還鮮有報道,以甘蔗渣栽培靈芝可解決傳統(tǒng)靈芝栽培過程中菌林矛盾等問題。啤酒糟是啤酒廠的副產(chǎn)物,粗蛋白含量達(dá)到25.7%[9],營養(yǎng)物質(zhì)豐富,而且相比麩皮、玉米粉等傳統(tǒng)有機(jī)氮源,成本更低,是一種優(yōu)質(zhì)的有機(jī)氮源,如果直接廢棄,不僅污染環(huán)境,也造成巨大浪費(fèi)。

因此,本實(shí)驗(yàn)以甘蔗渣為主要實(shí)驗(yàn)原料,進(jìn)行靈芝母種培養(yǎng)基篩選,以甘蔗渣為碳源,啤酒糟為氮源,篩選適合靈芝栽培的培養(yǎng)基,并比較分析了不同靈芝總?cè)祁惡康牟町惡筒煌囵B(yǎng)基栽培的靈芝子實(shí)體重金屬含量,篩選出能夠高效轉(zhuǎn)化利用甘蔗渣、啤酒糟等廢棄生物質(zhì)原料的靈芝菌種和培養(yǎng)料配方,促進(jìn)甘蔗渣的高值化利用及靈芝食品、保健食品開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

GL0002、GL0003 本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種,GL0057、GL0102 福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心提供;安徽椴木靈芝子實(shí)體 赤芝,購于大別山產(chǎn)區(qū);椴木栽培靈芝 赤芝,福建漳州菇農(nóng),GL0003;福建野生靈芝子實(shí)體 赤芝,漳州;廣東椴木靈芝子實(shí)體 赤芝,翁源;齊墩果酸準(zhǔn)品,香草醛,冰醋酸,高氯酸,乙醇,甲醇,石灰。

AA-300原子吸收分光光度計(jì) 美國鉑金埃爾默公司;UV-2550 紫外可見分光光度計(jì) 日本島津;XH-300UL 電腦微波超聲波紫外光組合催化合成儀 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 母種培養(yǎng)基篩選 四種培養(yǎng)基編號為CK(對照組)、①、②、③,具體配方如下所示:CK 馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g;①馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蛋白胨3.0 g,磷酸二氫鉀3.0 g,硫酸鎂1.5 g,維生素B20.1 g;②馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,甘蔗粉20 g,蛋白胨3 g,磷酸二氫鉀3 g,硫酸鎂1.5 g,維生素B20.1 g;③馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,甘蔗粉20 g;加水定容至1 L。每個配方重復(fù)5次,于28 ℃下培養(yǎng),每隔1 d生長劃線并觀察生長情況,待生長最快菌株長滿管后,拍照并統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.2 栽培培養(yǎng)基配方優(yōu)化 以蔗渣為主要碳源,工業(yè)廢棄物啤酒糟為主要氮源,設(shè)計(jì)培養(yǎng)基配方如下,編號分別為④、⑤、⑥,具體配方如下:④甘蔗渣82%,啤酒糟15%,石灰粉2%,糖1%;⑤甘蔗渣87%,啤酒糟10%,糖1%,石灰粉2%;⑥甘蔗渣77%,啤酒糟20%,糖1%,石灰粉2%;控制含水量在65%,每袋干料在330 g,每個配方接種5個重復(fù),接種量5%,于25～28 ℃暗培養(yǎng),保持空氣濕度50%～65%;待長滿袋后轉(zhuǎn)入栽培室,濕度控制在70%～80%,溫度控制在25～28 ℃,二氧化碳濃度為800 ppm左右;待長出小菇蕾,控制濕度75%～85%,加大通風(fēng)量,控制二氧化碳濃度為500～600 ppm;待子實(shí)體邊沿生長點(diǎn)消失,開始彈射孢子則關(guān)閉通風(fēng)和加濕設(shè)備,待彈完孢子后采收并收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)原料。

1.2.3 靈芝有效成分差異性研究 總?cè)坪繙y定:以1.2.2實(shí)驗(yàn)篩選到的最佳栽培配方所得的靈芝子實(shí)體粉碎、過40目篩為實(shí)驗(yàn)原料,靈芝子實(shí)體總?cè)铺崛》椒▍⒄找λ删萚10]的超聲波輔助提取法有改動,具體工藝參數(shù)是超聲功率為500 W,乙醇濃度為75%,超聲時間為20 min,料液比為1∶40,提取溫度為70 ℃,提取液經(jīng)過濾,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后用甲醇溶解,過濾并定容到50 mL;靈芝總?cè)茰y定方法參照廣東省地方標(biāo)準(zhǔn)DB44/T496-2008[11],以齊墩果酸為對照標(biāo)準(zhǔn)品,測定各組靈芝樣品提取物在545 nm處吸光度。靈芝子實(shí)體多糖提取與測定方法參照《中國藥典》[12]。

1.2.4 靈芝微量元素與重金屬含量測定 選取GL0003蔗渣栽培和椴木栽培靈芝(于福建漳州栽培)子實(shí)體、廣東靈芝、福建野生靈芝和安徽椴木靈芝粉碎,過40目篩,檢測方法參照陳紅香等[14]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝母種培養(yǎng)基篩選

本實(shí)驗(yàn)通過生長速度、菌絲體濃密度、菌絲爬壁能力和氣生菌絲量這四個指標(biāo)篩選出最適靈芝生長的培養(yǎng)基配方,結(jié)果見表1,4個供試菌株在③號培養(yǎng)基上,其生長速度除了菌株GL0002明顯被抑制之外其他3個菌株的生長速度與對照沒有明顯差別;但4個菌株的菌絲濃密度、爬壁能力和氣生菌絲量均比對照組弱。配方①是在PDA培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了蛋白胨、無機(jī)鹽和VB2,結(jié)果顯示:4個不同靈芝菌株在配方②培養(yǎng)基上生長,其長勢即菌絲濃密度、爬壁能力和氣生菌絲量均優(yōu)于對照組,在生長速度上菌株GL0102跟GL0003明顯優(yōu)于對照,該配方對GL0002和GL0057則具有一定的抑制作用。配方②是結(jié)合配方①與配方③,即在添加蛋白胨、無機(jī)鹽和VB2的基礎(chǔ)上再添加甘蔗渣粉,結(jié)果表明4個不同靈芝菌株在配方②上的生長速度與長勢均明顯優(yōu)于對照組和另外兩個配方。說明在PDA培養(yǎng)基基礎(chǔ)上只添加甘蔗渣粉對菌絲生長速度沒有顯著性差異,但會影響菌絲的長勢;而添加蛋白胨、無機(jī)鹽和VB2則會明顯提高菌絲的長勢,對生長速度的影響結(jié)果表現(xiàn)不一;同時添加甘蔗渣粉、蛋白胨、無機(jī)鹽和VB2,在生長速度與長勢上均具有顯著性優(yōu)勢,可用于靈芝菌種的保藏與復(fù)壯。

2.2 栽培料配方對靈芝產(chǎn)量的影響

從圖2實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見,4個靈芝菌株均在配方④上產(chǎn)量最高,菌株GL0003在子實(shí)體干重,直徑和厚度上均是配方④>配方⑤>配方⑥,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示配方④的子實(shí)體干重顯著高于配方⑥,與配方⑤沒有顯著性的差異,其子實(shí)體直徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果表現(xiàn)出一樣的趨勢,子實(shí)體厚度上配方④則顯著優(yōu)于配方⑤和配方⑥;菌株GL0102在子實(shí)體干重與厚度上是配方④>配方⑥>配方⑤,其子實(shí)體直徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果與菌株GL0003一致;菌株GL0002在子實(shí)體干重、直徑與厚度上同樣表現(xiàn)出與菌株GL0003一樣的趨勢;菌株GL0057子實(shí)體干重在三個配方上沒有顯著差異,三個配方在子實(shí)體直徑與厚度上的趨勢與其他三個菌株略有差異。4個靈芝菌株在配方④上子實(shí)體干重有所差異,結(jié)果顯示:GL0003與GL0102在配方④上子實(shí)體干重、直徑與厚度明顯優(yōu)于GL0057與GL0002,說明菌株GL0003與GL0102比較適合用該培養(yǎng)基栽培。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見,GL0003與GL0102在配方④上子實(shí)體干重均大于35 g,生物轉(zhuǎn)化率均超過10%。

表1 不同配方菌絲長勢比較

備注:小寫字母表示5%的顯著水平,大寫字母表示1%的顯著水平；*表示菌絲濃密度較低,**表示菌絲濃密度較高,***表示菌絲濃密度很高;+表示爬壁能力弱,++表示爬壁能力較強(qiáng),+++表示爬壁能力很強(qiáng)；#表示氣生菌絲少,##表示氣生菌絲較多,###表示氣生菌絲很多。

表2 靈芝微量元素含量測定

圖1 不同配方菌絲長勢比較Fig.1 Comparison of different formulation

2.3 不同栽培菌種有效成分含量差異

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示,用甘蔗渣栽培供試的4個靈芝菌株所得子實(shí)體總?cè)坪枯^為穩(wěn)定,都大于10 mg/g,兩個市售靈芝子實(shí)體的總?cè)坪吭?1～13 mg/g之間,略高于供試的4甘蔗渣栽培的靈芝,不同菌株間總?cè)坪看嬖诓町惒幻黠@,其中廣東椴木靈芝總?cè)坪孔罡?為12.34 mg/g,GL0102最低,含量為10.16 mg/g。甘蔗渣栽培靈芝菌株子實(shí)體多糖含量測定結(jié)果顯示:4個供試菌株子實(shí)體多糖含量均高于市售的2個椴木栽培靈芝,4個甘蔗渣栽培靈芝中GL0003子實(shí)體多糖含量最低,為34.20 mg/g,但其含量卻是廣東和安徽靈芝子實(shí)體的兩倍以上,這可能由于蔗渣栽培靈芝提取液顏色較深,對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定程度的干擾。比較甘蔗渣栽培靈芝與椴木栽培靈芝結(jié)果得出:甘蔗渣栽培靈芝子實(shí)體總?cè)坪可缘陀陂材驹耘囔`芝子實(shí)體,但甘蔗渣栽培靈芝子實(shí)體多糖含量卻是椴木栽培靈芝子實(shí)體的兩倍以上。另外,由于甘蔗渣栽培靈芝成本低廉,生長周期更短,因此從有效成分角度上看以蔗渣和啤酒糟為主要栽培基質(zhì)進(jìn)行靈芝培養(yǎng)可行。

2.4 靈芝微量元素與重金屬含量差異分析

幾種常見微量元素測定結(jié)果如下表2所示,從結(jié)果可見,相比其它品種靈芝,利用GL0003栽培的蔗渣靈芝和椴木靈芝富集Mg的能力更強(qiáng),分別達(dá)到1327.5 mg/kg和1246.2 mg/kg;供試的所有樣品Ge含量均較低;蔗渣栽培靈芝Se元素含量最高,為0.189 mg/kg;廣東椴木靈芝Mn含量顯著高于其它組合,達(dá)到98.1 mg/kg。

表3 靈芝主要重金屬含量測定

圖2 不同靈芝栽培農(nóng)藝性狀分析Fig.2 Characters analysis of Ganoderma lucidum cultivation

圖3 靈芝子實(shí)體有效成分Fig.3 The effective component of Ganoderma lucidum

樣品主要重金屬元素含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示,安徽椴木靈芝和廣東椴木靈芝的鎘元素含量較高,均超過中國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)[13]規(guī)定的小于0.5 mg/kg,其中廣東靈芝最高,為0.968 mg/kg;而福建野生靈芝銅和銀元素含量顯著高于其它組,分別達(dá)到60.6 mg/kg和0.961 mg/kg,銅含量超過了國家《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的銅含量<20 mg/kg;廣東靈芝的鉛含量最高,達(dá)到1.429 mg/kg,其次為福建椴木栽培靈芝,為1.173 mg/kg,超過國家規(guī)定的小于1 mg/kg的范圍,這可能是由于覆土栽培過程中土壤鉛含量過高引起的,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與唐杰等[15]結(jié)論一致;汞含量測定結(jié)果顯示安徽靈芝最高,為0.139 mg/kg,超過標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的小于0.1 mg/kg的范圍;砷測定結(jié)果中廣東市售靈芝最高,為0.374 mg/kg,在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定范圍內(nèi)(<1 mg/kg)?？v觀所有實(shí)驗(yàn)檢測指標(biāo),相比椴木栽培靈芝,蔗渣靈芝重金屬含量相對較低,都在允許范圍內(nèi),安全性更好。從重金屬含量檢測分析結(jié)果可得利用蔗渣栽培靈芝可行。

3 結(jié)論與展望

本研究以4種赤靈芝為出發(fā)菌株,篩選出最適靈芝栽培的培養(yǎng)基配方為:甘蔗渣81%,啤酒糟15%,石灰粉3%,糖1%,含水量為65%;在該配方上GL0003,子實(shí)體干重38.77 g,生物轉(zhuǎn)化率約為11.7%,子實(shí)體直徑子實(shí)體厚度分別為12.34 cm和19.19 mm,優(yōu)于高明等[16]篩選出的較優(yōu)棉花副產(chǎn)物料GMG栽培的靈芝,其單個子實(shí)體重量27.82 g,子實(shí)體直徑9.62 cm厚度0.73 cm;生物轉(zhuǎn)化率高于劉明香等[17]利用茶枝栽培的靈芝。

GL0003菌株多糖含量為34.20 mg/g,總?cè)坪繛?0.87 mg/g。其三萜含量略低于兩個市售椴木栽培靈芝,也低于劉明香[17]等用茶枝栽培的子實(shí)體(1.25 mg/g),但高于金珊珊等[18]用菌草芒萁與五節(jié)芒培養(yǎng)的雜交靈芝子實(shí)體;其多糖含量是4個供試菌株中最低的,卻優(yōu)于棉花副產(chǎn)物、菌草和茶枝栽培的子實(shí)體,這可能是與甘蔗渣營養(yǎng)組分有關(guān)。

靈芝具有較強(qiáng)的富集能力,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示栽培基質(zhì)和產(chǎn)區(qū)不同其重金屬含量存在差異,這與唐波等[19]的報道的結(jié)果一致;相比椴木栽培靈芝和野生靈芝,甘蔗渣栽培靈芝重金屬含量較低,微量元素Mg、Zn、Se等含量較高,安全性好。

靈芝具有豐富的保健功能,是中國保健食品領(lǐng)域的生力軍,但傳統(tǒng)以椴木、木屑栽培靈芝不僅成本較高且對環(huán)境破壞大,需求更經(jīng)濟(jì)、友好的生物資源進(jìn)行靈芝栽培刻不容緩。甘蔗渣為工業(yè)廢棄物,甘蔗渣來源廣、相對集中、營養(yǎng)豐富,而且屬于環(huán)境友好型資源,從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見利用蔗渣栽培的靈芝其有效成分多糖和三萜的含量也較高,加之利用甘蔗渣栽培靈芝生產(chǎn)成本低、生長周期短,因此利用蔗渣進(jìn)行靈芝栽培方法可行。目前蔗渣栽培靈芝工藝技術(shù)研究還處于起步階段,蔗渣栽培靈芝有效物質(zhì)活性及產(chǎn)量的調(diào)控技術(shù)有待深入研究;隨著對蔗渣栽培靈芝生物降解機(jī)理和功效的深入研究,菌糠的高值化研究將成為新的研究熱點(diǎn)。

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Study ofGanodermalucidumcultivating with bagasses & vinasse and composition analysis

HUANG Qing-hua1,2,3,WANG Qing-fu1,2,3,GAO Yu-feng1,LI Qi-wei1,2,3,LI Jin-rong1,2,3,MENG Fei1,2,3,LIANG Lei1,2,3,*

(1.Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute,Guangdong 510316,China; 2.Guangdong Engineering Research&Development Center for Comprehensive Utilization of Plant Fiber,Guangdong 510316,China;3.Guangzhou Key Laboratory for Comprehensive Utilization of Plant Fiber,Guangdong 510316,China)

In this work,the suitable formula for cultivatingGanodermalucidumwas optimized by evaluating the hypha growth rate,climbing ability,density of hypha and aerial hypha biological conversion. The best results were shown for the cultivating with potatoes 200 g,glucose 20 g,agar 20 g,bagasse 20 g,peptone 3 g,KH2PO43 g,MgSO41.5 g,and VB20.1 g per liter. Comparing to the dry weight,thickness and sporophore diameter of four kinds ofGanodermalucidum,GL0003 and GL0102 were proved to be the most suitable species,and their best media components were bagasses 82%,vinasse 15%,lime powder 2%,sugar 15%. The total triterpenoid contents result showed little difference between this two cultivation methods,all of them which grown on bagasse were higher than 10 mg/g;Comparing with basswood groups,the polysaccharide contents of bagasse groups were more than twice. The contents of the main heavy metal elements inGanodermalucidumgrown on bagassewas lower than that on basswood,but its organic magnesium,zinc and selenium content were higher than the basswood group,among them,the content of organic selenium was 0.189 mg/g.

bagasse;vinasse;Ganodermalucidum;heavy mental

2015-01-13

黃清鏵(1988-)，女，碩士，研究方向：微生物學(xué)、食品發(fā)酵，E-mail：kuangwty@163.com。

*通訊作者:梁磊(1980-)，男，博士，高級工程師，研究方向：食品發(fā)酵，生物質(zhì)高值化，E-mail：lianglei214@126.com。

廣州市珠江科技新星項(xiàng)目(2014J2200074)；科研院所技術(shù)開發(fā)研究專項(xiàng)資金(2013EG111222)；轉(zhuǎn)制院所創(chuàng)新能力專項(xiàng)資金(2014EG111227)；廣州甘蔗糖業(yè)研究所科技基項(xiàng)目(2013-04, B201305)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B0102003)資助；廣東省省級科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B060600001)。

TS255.1

A

1002-0306(2015)21-0143-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.021