八角茴香總黃酮抗氧化活性研究

王 碩,司建志,龔小妹,周小雷,繆劍華

(廣西藥用植物研究所 西南瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530023)

八角茴香總黃酮抗氧化活性研究

王 碩,司建志,龔小妹,周小雷,繆劍華*

(廣西藥用植物研究所 西南瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530023)

八角茴香總黃酮,抗氧化,超氧化物歧化酶,谷胱甘肽過氧化物酶

八角茴香(Illicium verum Hook. f. )的干燥成熟果實(shí)八角為我國特有香辛料和中藥材,主要分布于廣西、廣東、云南等地,其味辛,性溫,有溫陽散寒,理氣止痛功效,用于寒疝腹痛,腎虛腰痛等癥[1]。目前八角茴香中已被開發(fā)的生物活性成分主要為揮發(fā)油、合成雌激素己烷雌酚以及合成抗禽流感藥物“達(dá)菲”的莽草酸,而八角茴香中具有重要藥理作用的黃酮類成分尚未得到研究與開發(fā)。

近年來有關(guān)植物黃酮作為天然抗氧化劑的研究備受關(guān)注,對(duì)竹葉總黃酮[2]、沙棘葉黃酮[3]、銀杏黃酮[4]等植物黃酮的抗氧化活性研究表明黃酮類化合物是良好的天然抗氧化劑。研究發(fā)現(xiàn),八角茴香乙醇提取物能清除體外自由基,具有明顯的抗氧化活性[5],而黃酮類化合物作為八角茴香乙醇提取物中的重要成分,其抗氧化活性還未曾有學(xué)者進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)研究了八角茴香總黃酮(FIVR)體外對(duì)好氧自由基的清除率、總抗氧化能力以及體內(nèi)拮抗腹腔注射D-半乳糖致衰老小鼠所受氧化損傷,考察八角茴香總黃酮的抗氧化活性,旨在為八角茴香的綜合開發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明種小鼠,體重(20±2)g,廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):2009-0002;八角茴香總黃酮(西南瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實(shí)驗(yàn)室提供,總黃酮含量:87.5%),D-半乳糖(Ruitaibio,CAS:59-23-4),維生素C(廣西南寧百會(huì)藥業(yè)集團(tuán)有限公司,生產(chǎn)批號(hào):140303)。羥自由基試劑盒(生產(chǎn)批號(hào):20140411)、超氧陰離子試劑盒(生產(chǎn)批號(hào):20140410)、總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒(生產(chǎn)批號(hào):20140411)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(生產(chǎn)批號(hào):20140411)、谷胱甘肽過氧化物酶(GXH-Px)試劑盒(生產(chǎn)批號(hào):20140408)、考馬斯亮藍(lán)試劑盒(生產(chǎn)批號(hào):20140619),均購自南京建成生物工程研究所,其余試劑均為分析純。

UVmini-1240紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司;Sigma 4K15臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國Sartorius公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國光電器有限公司;JJ500型電子天平 常熟市雙杰測試儀器廠;CP224S型電子分析天平 德國Sartorius公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 對(duì)羥基自由基的清除作用 用雙蒸水將FIVR配制成0.1～1 mg/mL系列濃度的溶液,嚴(yán)格按照試劑盒說明書上操作,雙蒸水調(diào)零,在550 nm處測出對(duì)照管Aj,測定管Ai的吸光度。八角茴香總黃酮對(duì)羥基自由基的清除率(%)=(1-Ai/Aj)×100。

1.2.1.2 對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用 用雙蒸水將FIVR配制成0.1～1 mg/mL系列濃度的溶液,嚴(yán)格按照試劑盒說明書上操作,雙蒸水調(diào)零,在550 nm處測出對(duì)照管Aj,測定管Ai,空白管A0的吸光度。八角茴香總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除率(%)=[1-(Ai-A0)/(Aj-A0)]×100。

1.2.1.3 總抗氧化能力的測定 用雙蒸水將FIVR配制成0.1～1 mg/mL系列濃度的溶液,嚴(yán)格按照試劑盒說明書上操作,雙蒸水調(diào)零,在520 nm處測出測定管Ai、對(duì)照管Aj的吸光度,將在37 ℃每分鐘每毫升樣品溶液使反應(yīng)體系的吸光度值每增加0.01時(shí),為一個(gè)總抗氧化能力單位。八角茴香總黃酮總抗氧化能力=[(Ai-Aj)/0.01×30]×V0/V1。式中:V0為反應(yīng)液總體積;V1為樣品液體積。

1.2.2 體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn) 將60只昆明種小鼠(雌雄各半)隨機(jī)分為正常組(control)、模型組(model)、維生素C對(duì)照組(VC)、八角茴香總黃酮高(FIVR-H)、中(FIVR-M)、低(FIVR-D)劑量組,每組10只。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,參考文獻(xiàn)[6]制備衰老模型,除control組之外,各組小鼠每天腹腔注射D-半乳糖,注射劑量100 mg/g,control組小鼠注射等量的生理鹽水;FIVR-H、FIVR-M、FIVR-D每天灌胃八角茴香總黃酮水溶液,劑量為200、100、50 mg/g,VC組每天灌胃100 mg/g劑量的維生素C水溶液,control和model組每天灌胃等量的生理鹽水,連續(xù)給藥48 d,其間實(shí)驗(yàn)小鼠自由攝食飲水,每天稱量體重,根據(jù)體重調(diào)整給藥量。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抗氧化活性

圖1 FIVR、VC對(duì)·OH的清除能力Fig.1 The clearance rate of FIVR and VC on ·OH

圖2 FIVR、VC對(duì)的清除能力Fig.

2.1.2 總還原力(T-AOC)的測定 由圖3、圖4可見,由于所用抗氧化劑VC的純度很高,所以曲線上升很快。FIVR總還原力也隨著濃度上升而上升,FIVR的質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時(shí)的總還原力相當(dāng)于0.05 mg/mL VC的總還原力,表明FIVR具有較好的抗氧化活性。

組別1d11d21d31d41d空白組31.06±3.7236.58±4.7837.55±4.1539.57±5.0239.98±5.93模型組30.07±3.1534.66±4.49*34.71±3.4535.21±4.36**36.19±4.43**VC31.01±4.5035.94±6.2735.83±4.7735.71±3.7238.12±6.86FIVR-H31.28±3.1435.32±3.3735.36±2.4536.53±3.44*37.64±4.20*FIVR-M30.55±3.1734.61±4.2835.68±3.7536.71±4.34*38.04±4.67FIVR-D31.22±4.535.15±3.9734.13±3.4635.71±3.72**36.75±4.33*

注:與空白組比較:*p<0.05,**p<0.01。

表3 對(duì)衰老小鼠血清、肝組織、腦組織SOD的影響±s,n=10)

圖3 VC總還原力(T-AOC)Fig.3 Total antioxidative capacity of VC

圖4 FIVR總還原力(T-AOC)Fig.4 Total antioxidative capacity of FIVR

注:與空白組比較:*p<0.05,**p<0.01；與模型組比較:#p<0.05,##p<0.01，表2、表4同。

2.2 體內(nèi)抗氧化活性

2.2.1 對(duì)衰老小鼠體重及臟器指數(shù)的影響 由表1可以看出,隨著造模、給藥天數(shù)的增加,各實(shí)驗(yàn)組小鼠體重均低于正常組,其中模型組小鼠體重最低,但VC對(duì)照組和高、中、低劑量組小鼠體重與模型組相比均無顯著差異(p>0.05)。

由表2可以看出,各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟指數(shù)均明顯低于正常組,與模型組比較,VC對(duì)照組和高、中、低劑量組均有提高。各實(shí)驗(yàn)組小鼠腦指數(shù)均低于正常組小鼠,與模型組比較,VC對(duì)照組和高、中、低劑量組均有提高,高劑量組有顯著差異(p<0.05)。

組別肝指數(shù)腦指數(shù)空白組3.83±0.261.21±0.13模型組2.87±0.33**1.10±0.13*VC3.47±0.571.14±0.19FIVR-H3.31±0.34**##1.18±0.08#FIVR-M3.47±0.38*##1.14±0.12FIVR-D3.34±0.35**##1.15±0.12

2.2.2 對(duì)衰老小鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)的影響 由表3可以看出,與正常組比較,模型組血清、肝臟、腦組織中SOD的活性均顯著降低,其它各組SOD的活性也顯著下降(p<0.05,p<0.01)。與模型組比較,VC對(duì)照組,給藥組高、中劑量血清中SOD的活性均有提高;與模型組比較,VC對(duì)照組與給藥組高劑量肝臟組織中SOD 的活性有顯著提高,而中、低劑量組差異不明顯;與模型組比較,給藥組高、中劑量腦組織中SOD的活性有顯著提高,VC對(duì)照組與低劑量組差異不明顯。

2.2.3 對(duì)衰老小鼠體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的影響 由表4可以看出,與正常組比較,模型組血清、肝臟、腦組織中GSH-Px的活性均顯著降低;其它各組GSH-Px的活性也顯著下降。

組別劑量(mg/g·d)血液(U/mL)肝(U/mgprot)腦(U/mgprot)空白組-214.03±42.11532.44±49.09111.53±27.12模型組-123.01±24.92**419.85±32.40**55.94±16.73**VC100162.85±16.41#496.18±39.07##76.28±25.42FIVR-H200179.71±14.49##494.28±52.63#73.71±28.06FIVR-M100171.47±9.30##499.36±41.64##85.56±20.37#FIVR-D50157.35±39.02472.14±41.6673.92±19.17

與模型組比較,VC對(duì)照組,給藥組高、中劑量血清中GSH-Px的活性均有提高;與模型組比較,VC對(duì)照組,給藥組高、中劑量肝臟組織中GSH-Px 的活性均有提高;與模型組比較,給藥組中劑量腦組織中GSH-Px的活性有顯著提高,其余各組差異不明顯。

3 結(jié)論與討論

衰老自由基學(xué)說認(rèn)為,自由基在生物體衰老過程中起著重要作用[9]。自由基的積累導(dǎo)致細(xì)胞受到嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷,導(dǎo)致細(xì)胞衰老死亡。D-半乳糖經(jīng)糖醛還原酶的作用下生成不能被細(xì)胞代謝分解的半乳糖醇大量堆積在細(xì)胞內(nèi),影響細(xì)胞正常滲透壓,導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂,加劇氧化應(yīng)激反應(yīng),加深細(xì)胞所受的氧化損傷。D-半乳糖衰老模型比較符合自然衰老過程中的多種組織病理變化,是衰老研究中常用的一種衰老實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[10]。

本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射D-半乳糖的方法建立亞急性衰老小鼠模型,研究了八角茴香總黃酮體內(nèi)抗氧化活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與模型組比較,八角茴香總黃酮高、中劑量組能提高肝、腦的臟器指數(shù)。八角茴香總黃酮各給藥組均能提高D-半乳糖致衰老小鼠血清、肝臟與腦組織中SOD、GSH-Px的活性,拮抗D-半乳糖致衰老小鼠受到的氧化損傷,表明八角茴香總黃酮具有良好的抗氧化活性,這為進(jìn)一步開發(fā)八角茴香總黃酮天然抗氧化劑提供了科學(xué)依據(jù)。

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Study on antioxidative effect of total flavonoids from Illicium verum

WANG Shuo,SI Jian-zhi,GONG Xiao-mei,ZHOU Xiao-lei,MIAO Jian-hua*

(Institute of Guangxi Medicinal Plant,National engineering laboratory of southwest endangered medicinal resources development,Nanning 530023,China)

total flavonoids from Illicium verum;antioxidation;SOD;GSH-Px

2015-01-13

王碩(1973-),男,博士,副主任藥師,研究方向:中藥藥效篩選與新藥研發(fā),E-mail:ws428@163.com。

*通訊作者:繆劍華(1962-),男,博士,研究員,研究方向:藥用植物資源學(xué),E-mail:mjh1962@ vip.163. com。

國家科技支撐計(jì)劃“八角飲片及提取物質(zhì)量評(píng)價(jià)和生產(chǎn)過程標(biāo)準(zhǔn)研究”(2011BAI01B04)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)23-0075-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.007