利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)建立澳大利亞啤酒大麥醇溶蛋白標(biāo)準(zhǔn)圖譜

游麗華,李曉敏,王迎新,蔡國林,陸 健,4*

(1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室,江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122;3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無錫 214122;4.宿遷市江南大學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,江蘇宿遷 223800)

利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)建立澳大利亞啤酒大麥醇溶蛋白標(biāo)準(zhǔn)圖譜

游麗華1,2,3,李曉敏1,2,3,王迎新1,2,3,蔡國林1,2,3,陸 健1,2,3,4*

(1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室,江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122;3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無錫 214122;4.宿遷市江南大學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,江蘇宿遷 223800)

啤酒大麥的品種和質(zhì)量與麥芽的制作和啤酒的釀造緊密相關(guān)。選取國內(nèi)常用的3個進(jìn)口澳大利亞啤酒大麥品種Hindmarsh、Schooner、Vlamingh及國產(chǎn)啤酒大麥品種蘇啤3號和蘇啤6號為研究對象,獲得這5種啤酒大麥醇溶蛋白的標(biāo)準(zhǔn)雙向電泳圖譜,通過圖像分析結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF)鑒定技術(shù),對各品種澳麥電泳圖譜上的10個差異明顯的特征蛋白質(zhì)點和共同存在于這3個品種澳麥圖譜上的43個共同蛋白點進(jìn)行了鑒定,共成功鑒定出7個特異蛋白點和34個共同蛋白點,這些蛋白質(zhì)點構(gòu)成了以上3種啤酒大麥的蛋白標(biāo)志物庫。本研究為啤酒廠和麥芽廠的進(jìn)口啤酒大麥品種鑒定提供依據(jù)。

啤酒大麥,醇溶蛋白,蛋白質(zhì)組學(xué),品種鑒定,雙向電泳

啤酒大麥?zhǔn)瞧【漆勗斓闹饕?。近幾?國產(chǎn)啤酒大麥供應(yīng)量增加,但在質(zhì)量上仍存在不足[1],諸如品種混雜、蛋白質(zhì)含量高、麥汁浸出率低、皮殼厚、溶解慢等問題,而進(jìn)口啤酒大麥則在浸出率、發(fā)芽率上占有質(zhì)量優(yōu)勢,與國產(chǎn)大麥相比更適宜于啤酒釀造。因此,我國釀造啤酒的原料大麥長期依賴于進(jìn)口,主要進(jìn)口國為澳大利亞和加拿大[2]。由于進(jìn)口大麥品質(zhì)優(yōu)售價高,因而市場上常出現(xiàn)其他大麥混入進(jìn)口一級大麥的情況,影響到啤酒的生產(chǎn)及其品質(zhì)。因此,有必要對進(jìn)口啤酒大麥進(jìn)行品種純度及真實性鑒定。

傳統(tǒng)的大麥品種鑒定方法有感官鑒定法[3]和物理化學(xué)鑒定法[4-5]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,生物化學(xué)及分子生物學(xué)方法應(yīng)運而生,Draper實驗認(rèn)為大麥種子醇溶蛋白SDS-PAGE電泳圖譜可作為品種的生化“指紋”,用于品種和純度的鑒定[6];Weiss等分別采用醇溶蛋白SDS-PAGE電泳和糖蛋白印跡兩種方法對20種大麥進(jìn)行分組[7-8];林艷等利用SDS-PAGE電泳技術(shù)建立了8個加拿大啤酒大麥品種、3個澳大利亞啤酒大麥品種和4個法國啤酒大麥標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE圖譜庫[9-10]。但是,SDS-PAGE等方法存在分辨率低的問題,使得鑒定結(jié)果不夠準(zhǔn)確[11]。國外已有利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對啤酒大麥相關(guān)蛋白質(zhì)做過研究,而利用該技術(shù)進(jìn)行大麥品種鑒定的文獻(xiàn)報道卻很少[12-16],且與我國進(jìn)口的啤酒大麥品種有差別,無法滿足我國對進(jìn)口啤酒大麥品種鑒定的需求,因而,需要對大麥種子蛋白質(zhì)組作進(jìn)一步分析[17]。

圖1 大麥種子醇溶蛋白的提取Fig.1 Extraction procedure of barley seed hordein

本文對國內(nèi)麥芽公司常用的3個進(jìn)口澳大利亞啤酒大麥(Hindmarsh、Schooner、Vlamingh,目前國內(nèi)啤酒行業(yè)普遍使用的澳大利亞啤酒大麥)和2個江蘇啤酒大麥(目前國內(nèi)啤酒行業(yè)普遍使用的江蘇啤酒大麥)分別進(jìn)行研究,利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)建立各啤酒大麥品種醇溶蛋白標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫和蛋白質(zhì)標(biāo)志物庫,為啤酒廠和麥芽廠的進(jìn)口啤酒大麥品種鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 啤酒大麥樣品 進(jìn)口澳麥Vlmingh、Hindmarsh、Schooner由國內(nèi)某麥芽公司提供;江蘇啤酒大麥蘇啤3號、6號由江蘇省鹽城農(nóng)科院提供。所有啤酒大麥均為2012～2013年度樣品。

1.1.2 實驗試劑 瓊脂糖、溴酚藍(lán)、碘乙酰胺(IAM)、二硫蘇糖醇(DTT)、3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、N,N,N′N′-四甲基乙二胺(TEMED)、尿素、硫脲 為GE公司產(chǎn)品;礦物油、17cm IPG膠條(pH3～pH10,非線性)、載體兩性電解質(zhì)(pH3～10,非線性)為Bio-Rad公司產(chǎn)品;α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、碳酸氫銨、三氟乙酸(TFA)、胰蛋白酶、乙腈等購于Sigma公司;30%丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉(SDS)、過硫酸銨(APS)、考馬斯亮藍(lán)G-250、考馬斯亮藍(lán)R-250、牛血清蛋白、Tris、蛋白標(biāo)準(zhǔn)物 為上海生工進(jìn)口分裝產(chǎn)品;其余試劑為分析純產(chǎn)品,購于國藥集團(tuán)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

EttanTMIPGphor III等電聚焦儀、EttanTMDALT Six垂直電泳系統(tǒng)、Image Scanner掃描儀 瑞典GE公司;Ultraflextreme串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀 德國Bruker公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 醇溶蛋白的分級提取 啤酒大麥種子經(jīng)粉碎處理液氮研磨至粉末狀,稱取3g粉末先后經(jīng)過去離子水、5%(w/v)NaCl及75%(v/v)乙醇分級提取,得到大麥醇溶蛋白,具體詳見圖1[18]。

采取三氯乙酸(TCA)-丙酮法[19]沉淀蛋白,即向蛋白上清液中加入4倍體積20%的預(yù)冷的TCA丙酮溶液,搖勻,-20℃過夜放置沉淀蛋白,4℃、12000r/min離心30min。棄上清,收集沉淀,加入一定體積預(yù)冷的丙酮溶液,清洗沉淀,4℃、12000r/min離心20min。重復(fù)清洗2次,棄上清,收集沉淀,自然晾干使丙酮完全揮發(fā);將醇溶蛋白溶解于適量的蛋白裂解液(8mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%(w/v)CHAPS、0.8%(w/v)兩性電解質(zhì)及1%(w/v)DTT),置于-20℃冰箱中保存。利用Bradford方法[20]測定蛋白質(zhì)濃度。

1.3.2 醇溶蛋白的雙向電泳 選用長度17cm的IPG膠條,(pH3～pH10,非線性),蛋白樣品(500～800μg)加入水化液至終體積350μL。取出膠條室溫下放置10min,沿水化槽加入樣品,用鑷子輕輕去除IPG膠條上的保護(hù)層。將IPG膠條膠面朝下放入水化液上,避免產(chǎn)生氣泡,蓋上礦物油。將膠條槽放入Ettan IPGphor III 等電聚焦儀,聚焦程序見表1。

等電聚焦完成后,用鑷子取出膠條,膠面朝上放在濕潤的濾紙上,吸去支持膜上的礦物油,將膠條放入膠條盤內(nèi)(膠面朝上),利用兩步平衡法進(jìn)行膠條平衡:平衡液母液+1% DTT,15min;平衡液母液+1.25% IAM,15min。膠條平衡液母液:8mol/L尿素,2% 十二烷基磺酸鈉(SDS),50mmol/L Tris-HCl(pH6.8),30%(v/v)甘油,0.002g/L溴酚藍(lán)。

表1 等電聚焦程序Table 1 Isoelectric focusing electrophoresis program

膠條平衡后轉(zhuǎn)移至配制好的12.5%丙烯酰胺凝膠上,用0.5%瓊脂糖封住凝膠上部,進(jìn)行二向SDS-PAGE電泳:先2W/gel電泳1h,然后調(diào)至14W/gel,當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移到凝膠底部時,關(guān)閉電源,結(jié)束電泳。剝離凝膠,置于考馬斯亮藍(lán)G-250染色液中染色過夜,置脫色液(3%冰醋酸)中脫色(約5～8h),直到背景無色透明,蛋白點清晰為止[21]。

1.3.3 凝膠圖像分析 使用Image Scanners掃描儀對凝膠進(jìn)行掃描并保存圖像;用PDQuest 8.0軟件對凝膠圖像上的蛋白點進(jìn)行檢測,所有圖像選擇自動找點模式,并手動校正以去除背景噪音和橫縱條紋。對不同樣品的雙向電泳圖譜選擇匹配和對比分析,找出差異蛋白點。為避免系統(tǒng)誤差,每個樣品需要進(jìn)行三次實驗重復(fù)。

1.3.4 質(zhì)譜鑒定(MALDI-TOF/TOF) 通過軟件分析得到的差異蛋白點進(jìn)行手動切膠,將挖取的蛋白點凝膠轉(zhuǎn)移至EP管中,加入200μL脫色液(30%乙腈/0.1%TFA的碳酸氫銨溶液),震蕩脫色至膠粒呈無色。棄掉脫色液,膠粒用50μL的乙腈脫水兩次,得到白色膠粒。每個脫水后的膠粒加入5μL胰蛋白酶溶液,置于4℃吸收30～60min,使膠粒充分吸脹,結(jié)束后吸出未被吸收的酶液,加入20μL、25mmol/L碳酸氫銨溶液覆蓋膠粒,37℃水浴酶解20h。酶解液吸出后加到新的EP管中,原管中加入20μL、60%乙腈/0.1% TFA萃取液,超聲15min,凍干待用[21]。

凍干的酶解樣品用3μL、0.1% TFA復(fù)溶,將0.7μL CHCA基質(zhì)溶液與0.7μL酶解液先后點在Anchorchip靶板中心的疏水區(qū)。再用2μL、0.1% TFA進(jìn)行脫鹽。一級質(zhì)譜采用正離子模式,二級質(zhì)譜分析幾個強度較高的一級圖譜峰,用Mascot軟件(http://www.matrixscience.com)在NCBInr數(shù)據(jù)庫中對蛋白質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行搜索匹配。

2 結(jié)果與討論

本研究根據(jù)2012～2013年度我國進(jìn)口澳麥量,選取主要品種Hindmarsh、Schooner和Vlamingh,以及國內(nèi)產(chǎn)量較高的江蘇啤酒大麥蘇啤3號和蘇啤6號進(jìn)行研究。

2.1 各啤酒大麥醇溶蛋白的雙向電泳圖譜

對Hindmarsh、Schooner、Vlamingh、蘇啤3號和蘇啤6號,分別提取醇溶蛋白,并進(jìn)行雙向電泳,獲得醇溶蛋白圖譜。為減小誤差,每個大麥樣品進(jìn)行3次重復(fù),得到其醇溶蛋白標(biāo)準(zhǔn)圖譜如圖2。

圖2 不同品種啤酒大麥醇溶蛋白2-DE圖譜Fig.2 2DE maps of hordeins from different barley cultivars注:a. Hindmarsh;b. Schooner;c. Vlamingh;d. 蘇啤3號;e. 蘇啤6號。

采用pH3～pH10(圖譜上從左至右pH變化范圍為3到10)的非線性膠條,既保證了絕大部分等電點(pI4～6和pI8～9)的蛋白質(zhì)能夠展現(xiàn)在凝膠圖譜上,同時避免了由于蛋白質(zhì)過多造成圖譜上蛋白質(zhì)斑點集中、無法有效辨別的情況。從圖中可以看出,蛋白質(zhì)點清晰,無明顯橫條紋或縱條紋,雙向電泳分離效果較好,從肉眼觀察看,各品種醇溶蛋白點在圖譜上分布形狀和位置有明顯不同,再次證明醇溶蛋白可作為啤酒大麥品種標(biāo)記物,且可初步通過各品種醇溶蛋白在二維凝膠圖譜上的分布狀態(tài)對品種進(jìn)行初步鑒定。

經(jīng)PDQuest軟件分析,各進(jìn)口啤酒大麥醇溶蛋白圖譜中檢測到約50個蛋白質(zhì)點,發(fā)現(xiàn)各品種間存在多個共同的蛋白點及明顯的差異蛋白點。蘇啤3號和蘇啤6號電泳圖譜存在明顯的差異,進(jìn)口啤酒大麥與江蘇啤酒大麥的醇溶蛋白圖譜也存在明顯差異,與國產(chǎn)啤酒大麥醇溶蛋白圖譜相比,進(jìn)口啤酒大麥醇溶蛋白質(zhì)點在圖譜上分布較清晰,且無明顯的橫縱條紋,可能是與啤酒大麥的品種及其質(zhì)量有關(guān)。實驗結(jié)果表明,通過分級提取方法建立的雙向電泳圖譜重復(fù)性好,分辨率高,適合用構(gòu)建大麥種子蛋白的雙向電泳圖譜。

2.2 啤酒大麥醇溶蛋白圖譜中共同蛋白點分析

成熟的大麥籽粒中,醇溶蛋白約占總蛋白含量的40%～60%,根據(jù)分子量的不同,可將其分為A(或γ)、B、C和D四組多肽,B(28～45ku)和C(49～72ku)組分別占總醇溶蛋白的70%～80%和10%～20%,且它們在蛋白組成上差異明顯,適宜用于大麥品種鑒定[22]。

表2 34個蛋白點鑒定結(jié)果Table 2 Results of 34 identified protein spots

注:a為大麥;b為小麥;c為蘚類;d為微細(xì)胞藻類;e為藻類。

利用PDQuest8.0軟件,對獲得的3個澳大利亞啤酒大麥品種及2個品種的江蘇啤酒大麥醇溶蛋白標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行分析,選擇Hindmarsh為參考譜圖,在5個品種大麥圖譜中共檢測到43個共同蛋白點,見圖3。

圖3 啤酒大麥標(biāo)準(zhǔn)圖譜中共同蛋白點Fig.3 Common proteins of hordeins of barley standard 2DE maps

對圖譜上的共同蛋白點進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜鑒定,成功鑒定34個蛋白點,其余9個點可能由于蛋白點濃度低或數(shù)據(jù)庫不完整鑒定不成功,通過數(shù)據(jù)庫檢索得到共同蛋白點鑒定結(jié)果如表2。結(jié)果顯示大部分蛋白點鑒定為大麥醇溶蛋白,如B組、C組和D組醇溶蛋白,或為醇溶蛋白前體物,另外一部分蛋白點鑒定為α-淀粉酶抑制劑和胰蛋白酶抑制劑家族,這類蛋白可溶于氯仿/甲醇,因此也屬于醇溶蛋白;此外,還有少量鑒定出的假定蛋白和未知蛋白。

2.3 3個澳麥品種標(biāo)準(zhǔn)圖譜中特異蛋白點分析

利用軟件PDQuest 8.0對3個品種大麥的標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行分析,得到各品種澳麥標(biāo)準(zhǔn)圖譜中差異較明顯的特異蛋白點(見圖4中箭頭所指的點),分子量主要分布在14.4 ～66.2ku。

圖4 進(jìn)口啤酒大麥醇溶蛋白圖譜差異蛋白分析Fig.4 Variance analysis of 2-DE maps of imported barley hordein注：a. Hindmarsh;b. Schooner;c. Vlamingh。

各圖譜中的特異點經(jīng)MALDI-TOF/TOF 質(zhì)譜鑒定(表3),共挖取10個特異蛋白點,成功鑒定出7個,其中D-hordein為Hindmarsh的特異蛋白(由于挖取的蛋白質(zhì)點顏色淺濃度低或數(shù)據(jù)庫不完整,其余3個蛋白點未成功鑒定出);Schooner品種中的特異蛋白為BTI-CMe 2.2 protein和α-淀粉酶抑制劑 BDAI-1;鑒定得Vlamingh的差異蛋白為:α-amylase/trypsin inhibitor CMa、BTI-CMe 1、hordoindoline A-1、B3-hordein。對這3個品種澳麥圖譜進(jìn)行選擇匹配和對比分析,共鑒定出34個共同蛋白點,及7個屬于每個品種的特異蛋白,這些蛋白點構(gòu)成了這3個澳麥品種的蛋白標(biāo)志物庫。

表3 差異蛋白點質(zhì)譜鑒定結(jié)果Table 3 Results of protein spots by mass spectrometry

各品種大麥醇溶蛋白圖譜中的特異蛋白,可作為品種鑒定的標(biāo)志物,如通過提取未知大麥樣品的蛋白質(zhì)并進(jìn)行目標(biāo)品種特征蛋白的質(zhì)譜掃描,通過特征蛋白質(zhì)譜信號的有無判斷是否為目標(biāo)品種大麥;或通過混種實驗針對目標(biāo)品種特征蛋白或其mRNA,利用Western或RT-PCR等定量方法,建立目標(biāo)品種大麥純度與特征蛋白表達(dá)量之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線,為開發(fā)高效準(zhǔn)確鑒定大麥品種及純度的方法提供技術(shù)基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

本研究以近年來進(jìn)口量較大的3個進(jìn)口澳大利亞啤酒大麥Hindmarsh、Schooner、Vlamingh及2個產(chǎn)量較大的江蘇啤酒大麥蘇啤3號、蘇啤6號為研究對象,通過雙向電泳實驗,建立了各進(jìn)口啤酒大麥及國產(chǎn)大麥醇溶蛋白標(biāo)準(zhǔn)圖譜,發(fā)現(xiàn)了進(jìn)口啤酒大麥品種特異蛋白,其中,D-hordein、BTI-CMe 2.2 protein和α-amylase inhibitor BDAI-1、α-amylase/trypsin inhibitor CMa可分別作為Hindmarsh、Schooner和Vlamingh的特異蛋白,對于未鑒定成功的特征蛋白,還需要對其使用價值進(jìn)行進(jìn)一步評價,為啤酒大麥品種鑒定提供技術(shù)依據(jù)。

采用雙向電泳及質(zhì)譜鑒定技術(shù)相結(jié)合的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對啤酒大麥進(jìn)行品種鑒定,避免了傳統(tǒng)鑒定技術(shù)結(jié)果的不準(zhǔn)確性及SDS-PAGE電泳分辨率低等問題。近幾年來,蛋白質(zhì)組學(xué)以其大規(guī)模、高通量、高靈敏度、全局性的技術(shù)優(yōu)勢[23],在發(fā)現(xiàn)新型生物標(biāo)志物、藥靶和藥物的重要途徑等生物醫(yī)藥及相關(guān)領(lǐng)域迅速發(fā)展[24]。而得益于模式植物基因組的測序工作和蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)發(fā)展的植物蛋白質(zhì)組學(xué)也將取得更深遠(yuǎn)的進(jìn)展,在大麥品種和純度鑒定中將發(fā)揮重要作用。

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Proteomic profile of hordeins from different varietiesof Australian malting barley

YOU Li-hua1,2,3,LI Xiao-min1,2,3,WANG Ying-xin1,2,3,CAI Guo-lin1,2,3,LU Jian1,2,3,4，*

(1.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;3.School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;4.Industrial Technology Research Institute of Jiangnan University in Suqian,888 Renmin Road,Suqian 223800,China)

The properties and cultivars of malting barley are closely related with malt production and brewing process. Three commonly used Australia malting barley varieties(Hindmarsh,Schooner and Vlamingh),and domestic Supi#3 and #6 were investigated. Then standard two-dimensional electrophoresis profiles of hordeins from those five malting barley were obtained. Ten characteristic protein spots with significant differences of each malting barley cultivar and forty-three common protein spots of the three Australia barley maps were identified with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight(MALDI-TOF/TOF),and seven characteristic proteins and thirty-four common proteins were successfully identified for constructing the protein marker library of the five malting barley cultivars. This research provided a basis to promote application of this technology in domestic brewery and malting companies.

malting barley;hordein;proteomics;variety identification;two-dimensional electrophoresis(2DE)

2014-07-24

游麗華(1988-),女,碩士研究生,研究方向：釀酒科學(xué)與工程。

*通訊作者:陸健(1968-),男,博士，教授,主要從事釀造酒微生物與酶技術(shù)研究。

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目(2013CB733602);國家863計劃(2013AA102109);國家自然科學(xué)基金項目(31171736);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目(JUSRP1015);江蘇省普通高等學(xué)校科研成果產(chǎn)業(yè)化推進(jìn)項目(JHB2012-26);江蘇省科技支撐計劃項目(BE2012397);安全食品精深加工科技創(chuàng)新平臺建設(shè)(2012B091400030);江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目。

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1002-0306(2015)13-0282-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.051