ALA和GNT對蘋果果皮中多酚、酶活及相關(guān)基因的影響

白 鴿,郭玉蓉,陳 磊

(陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院,陜西西安 710119)

ALA和GNT對蘋果果皮中多酚、酶活及相關(guān)基因的影響

白 鴿,郭玉蓉*,陳 磊

(陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院,陜西西安 710119)

目的:探究5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid,ALA)和金雀異黃素(Genistein,GNT)對蘋果果皮總酚含量、花青苷、相關(guān)酶活性以及基因表達量的影響。方法:在“秦陽”蘋果摘袋時,分別用質(zhì)量濃度為300mg·L-1的ALA、21.62μg·L-1的GNT、ALA+GNT(300mg·L-1的ALA和21.62μg·L-1的GNT 1∶1混合溶液)進行田間實驗;并用全波長酶標儀測定處理后蘋果皮總多酚、花青苷含量和相關(guān)酶活性,用熒光定量法測定各基因表達量。結(jié)果:蘋果果皮顏色越紅,花青苷含量越高,花青苷合成相關(guān)基因表達量越高;使用ALA處理過的蘋果,果皮中總多酚含量最高,同時其多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)酶活性最低;對于苯丙氨酸解氨酶(phenylalanin ammonia-lyase,PAL)酶活性,用GNT和ALA處理過的蘋果差異不顯著且均高于其它處理。結(jié)論:ALA和GNT有利于花青苷的積累,可用于人工控制早、中熟蘋果著色,以提高其市場競爭力。

5-氨基乙酰丙酸,金雀異黃素,多酚,酶活性,基因表達量

蘋果因栽培品種和種植環(huán)境條件的不同,成熟蘋果的大小、形狀、顏色、酸甜度及其他品質(zhì)特性差異很大[1]。果實外觀品質(zhì),特別是紅色果實著色程度既是一個品種的典型特征,也是果實品質(zhì)與成熟度的重要指標,還是消費者選購時的重要依據(jù)[2],蘋果的市場認可度主要由蘋果表皮顏色決定:顏色越好的蘋果,消費者越喜愛[3-5]。早、中熟蘋果品種成熟時果皮顏色較差,嚴重影響了其市場競爭力[6]。而在果實色澤的形成過程,花青苷發(fā)揮著重要作用,其種類和分布狀況與果實色澤密切相關(guān)[7]。當然,對于不同顏色的蘋果,有關(guān)酶的活性及基因表達量也不相同。通過前人的研究,我們發(fā)現(xiàn)噴施外源5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid,ALA)溶液和金雀異黃素(Genistein,GNT)溶液,可以極大的提高蘋果的著色效果[8-9]。本實驗為闡明不同顏色蘋果外觀品質(zhì)與內(nèi)在形成提供了理論研究,同時也為人工控制早、中熟蘋果顏色形成,提高市場競爭力,擴大市場提供可行的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘋果 實驗選擇西北農(nóng)林科技大學白水實驗站的10年生“秦陽”蘋果樹。在蘋果摘袋前,挑選5株10年生、樹勢接近的果樹作為實驗樹。摘袋時分別用質(zhì)量濃度為300mg·L-1ALA、21.62μg·L-1GNT、ALA+GNT噴施3株實驗樹陽面的大小一致、無病蟲害及機械損傷的蘋果,剩余的2株實驗樹,1株給予正常光照(Light)作為對照樹,另1株作完全套袋黑暗(Dark)處理。每5d噴施一次,共4次,第20d時采收,用冰盒帶回實驗室,進行相關(guān)實驗測定。PCR引物 生工生物工程(上海)股份有限公司合成;其它試劑 國產(chǎn)分析純或化學純。

PIKO REAL 96RT-PCR儀 美國Thermo公司;反轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒和熒光染料 生工生物工程(上海)股份有限公司;Multiskan Go全波長酶標儀 美國Thermo;TGL-16G高速低溫離心機 上海安亭科學儀器廠;Dionex UPLC液相分析系統(tǒng) 美國Dionex公司和Dikma HPLC柱(250mm×4.6mm,5μm)。

1.2 花青苷含量和組分的測定

1.2.1 總花青苷含量測定 參照王延玲[10]的方法,稍加改動。取0.5g果皮,液氮充分研磨后加入2mL 1% HCl/甲醇溶液在4℃冰箱黑暗提取12h。用分光光度計測定提取液在553nm 和 600nm處吸光值。以每克果皮鮮重的提取液的光密度變化值D553 nm-D600 nm=0.01作為一個花青苷單位,用U表示。

1.2.2 花青苷組分測定 果皮用液氮研磨成粉末,按照料液比1∶4(g∶mL)加入1% HCl/甲醇溶液,4℃暗置浸提2h。將提取液在4℃、12000r/min 離心10min,上清液經(jīng)0.22μm 的濾膜過濾后,取400μL轉(zhuǎn)移至進樣瓶中等待進樣。Dionex UPLC液相分析系統(tǒng)(Dionex,美國)和Dikma HPLC柱(250mm×4.6mm,5μm);溶液A(乙腈)和溶液B(1‰三氟乙酸)。洗脫條件參照王延玲[10]的方法,稍加改動。利用溶液B進行梯度洗脫:0min,88% B;1min,88% B;15min,70% B;20min,70% B;25min,88% B;30% min,88% B。柱溫 30℃流動相速度:1.0mL·min-1,進樣量20μL,在500nm波長進行花青苷組成的檢測,記錄出峰時間,和標品進行比對鑒定花青苷的成分。

1.3 總酚含量測定

總酚測定標準曲線的繪制:用5mL 70%乙醇溶解0.2500g沒食子酸,定容至50mL,分別移取0.5、1.0、1.5、2.5、5.0mL至容量瓶中,用水定容50mL,制備濃度分別為50、100、150、250、500mg·L-1的沒食子酸溶液。從上述不同濃度的標準溶液中分別移取0.5mL加入到50mL容量瓶中后分別加入30mL去離子水,混勻,加入2.5mL Folin-Ciocalteu試劑,混勻后,加入7.5mL 20%碳酸鈉溶液,混合,定容。將上述標準溶液在20℃下黑暗靜置2h后,在765nm波長下測定吸光值,從而得到標準曲線[11-12]。

參照任文霞[13]的方法,稍加改動。每次用蒸餾水洗凈實驗果,濾紙吸干表面水分,粉碎,取1.0g果皮,加入20mL 70%乙醇,55℃超聲輔助提取4次,定容至100mL。取1.0mL提取液,依次加入12mL飽和Na2CO3溶液和1.0mL福林酚溶液,定容至25mL。避光反應1h后,于765nm處檢測OD值,通過標準曲線的換算,總多酚含量用沒食子酸的當量值表示。

1.4 苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活性測

參照林植芳[14]的方法,略作修改。每次用蒸餾水洗凈實驗果,用濾紙吸干表面水分,粉碎后取0.5g果肉,加入5mL 0.05mol·L-1pH8.8的硼酸緩沖液(內(nèi)含0.005mol·L-1β-巰基乙醇),然后加入0.1g 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和少許石英砂,冰浴下研磨成勻漿,4℃下12000r·min-1離心20min,上清液為酶液,用來測定酶活性。

酶活性測定反應體系:0.02mol·L-1L-苯丙氨酸(用0.1mol·L-1、pH8.8的硼酸緩沖液配制)1.0mL,0.05mol·L-1硼酸緩沖液2.0mL,1.0mL酶液,30℃水浴30min,在290nm處測定OD值。每克鮮重每分鐘所引起吸光度變化 0.001為一個酶活力單位。

1.5 多酚氧化酶(PPO)酶活性測定

酶液的制備[15-16]:取3.0g果肉樣品,加2mL 100mmol/L pH為5.5的醋酸緩沖溶液,冰浴研磨勻漿,在4℃條件下14000r/min離心30min,取上清液作為酶液,測定PPO酶活性。

PPO活性檢測:反應體系為2mL 50mmol/L pH為5.5的醋酸緩沖溶液,0.6mL 1mol/L鄰苯二酚溶液,0.2mL 酶液;從加入酶液1min開始,記錄每分鐘反應體系在420nm 波長的吸光度值,連續(xù)測定2min。以每分鐘ΔOD420為一個酶活單位U。

1.6 實時定量RT-PCR

1.6.1 cDNA模版的制備 取-80℃凍存的蘋果皮,采用改良的CTAB-LiCl法提取蘋果皮總RNA[17],用快速RNA檢測儀對RNA的濃度及純度進行檢測,選擇OD260/OD280值在1.8～2.0之間的RNA,利用TaKaRa公司提供的cDNA試劑盒將蘋果皮總RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA,并將cDNA濃度統(tǒng)一稀釋至100ng·μL-1,-20℃保存?zhèn)溆?用cDNA模版進行實時定量RT-PCR。

表1 熒光定量引物序列Table 1 Quantitative primers

1.6.2 qRT-PCR擴增 根據(jù)候選基因的序列,用primer 5.0 軟件設計引物,以蘋果管家基因β-actin為內(nèi)參,引物序列見表1,委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成。熒光定量PCR以SYBR為熒光染料,采用10μL體系,包括:5.0μL SYBR premix Ex TaqTM(2*)反應液,0.2μL RcxDag(2*),上下游引物各0.4μL,cDNA模版2μL,加ddH2O補至10μL。混勻,離心,放入PCR儀擴增。反應程序為:95℃預變性30s;進行40個循環(huán),循環(huán)條件為95℃,5s;n℃(n為摸索的各個基因退火溫度),30s;60℃延伸30s;溶解溫度從n℃到95℃每升高0.2℃保持1s。反應中設置空白對照,使用雙蒸水為模版,每個樣品重復三次。反應結(jié)束后記錄Ct值,采用2-ΔΔCt法[18]進行數(shù)據(jù)分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)均重復3次以上,使用SPSS18.0數(shù)理統(tǒng)計分析軟件進行顯著性分析(Duncan分析),并用Excel進行作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 花青苷含量和組分的變化

總花青苷含量的檢測結(jié)果如圖1a所示。對于分別用A+G、GNT、ALA、Light、Dark 5種方法處理得到的不同顏色的蘋果皮,(A+G)處理組顏色最紅，GNT次之，ALA低于GNT，其果皮顏色越紅,花青苷含量越高。A+G處理過的蘋果,果皮中花青苷的含量顯著(p<0.05)高于其它四種實驗樣果,是Light的3倍;Dark處理的樣果花青苷含量則顯著低于其它四種處理的樣果,僅是Light組的0.05。另外,GNT和ALA處理過的蘋果皮中花青苷的含量總和小于用A+G處理過的。由此可初步推斷GNT與ALA均可促進花青苷積累,且二者具有協(xié)同作用。這與王中華[8]在蘋果上和朱云娜[19]在葡萄上得到的實驗結(jié)果是一致的。

通過高效液相色譜法,可以確定蘋果皮中花青苷的主要組分為矢車菊素-3-半乳糖苷(Cyanidin-3-galactoside,Cy-3-gal),其相對含量如圖1b所示。Dark處理的樣果中未檢出Cy-3-gal,這是因為Dark處理的果皮中花青苷含量本身極低,因此其中所含Cy-3-gal量過低,低于液相的檢測下限濃度,導致未被檢出。同時,完全套袋處理實驗組的加入,證明了光照能顯著增強花青苷的合成,這與俞明亮[20]的研究結(jié)果是相符合的。

圖1 不同蘋果果皮顏色對花青苷含量的影響Fig.1 Different color of apple peel impact on anthocyanin content and component注:不同小寫字母表示不同處理得到的不同顏色蘋果果皮中花青苷含量的差異顯著(p<0.05),圖2～圖6同。

2.2 總酚含量的變化

總酚含量的標準曲線為:y=9.9680x+0.0030,R2=0.9989,其檢測結(jié)果如圖2所示。對于分別用5種方法處理得到的不同顏色的蘋果皮,用ALA處理過的蘋果果皮中多酚含量達到最高,為16.46mg沒食子酸/g干物質(zhì),完全套袋處理的含量最低,為12.14mg沒食子酸/g干物質(zhì),其余3種處理含量無顯著性差異(p>0.05)。同時,也可以從圖中看出,果皮顏色并未與總多酚含量呈正相關(guān),果皮顏色越紅,總酚含量不一定越高。這是因為蘋果多酚的主要成分綠原酸、表兒茶素等與花青苷的主要成分Cy-3-gal之間存在一定的拮抗作用,結(jié)合圖1a和圖2:花青苷含量升高時多酚含量會有所下降;而多酚含量較高時,相對應的花青苷含量則較低,這與Jamil Harb等[21]的研究結(jié)果是一致的。

圖2 不同蘋果果皮顏色對總酚含量的影響Fig.2 Different color of apple peel impact on total phenol content

2.3 PAL酶活性測定

PAL酶活性的測定結(jié)果如圖3所示,由圖可以看出,隨著蘋果顏色逐漸變淺,PAL酶的活性呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢,用GNT處理過的蘋果其酶活性最強,而完全套袋處理的蘋果PAL酶活性明顯弱于其它處理樣果,由此可以說明避光處理會極大的抑制PAL酶的活性。另外,由圖可以看出用A+G、GNT、ALA處理過的蘋果果皮中PAL酶活性均顯著高于對照組,說明果皮顏色與酶活性顯著相關(guān)。

圖3 不同蘋果果皮顏色對PAL酶活性的影響Fig.3 Different color of apple peel impact on PAL enzyme activity

2.4 PPO酶活性測定

PPO酶活性的測定結(jié)果如圖4所示,不同處理間的酶活性差異極為顯著,其中酶活性最弱的是用ALA處理的蘋果,酶活性最強的是Dark處理的蘋果,其PPO酶活性為ALA處理果的1.5倍。當PPO酶活性較強時,蘋果皮中的總多酚因分解較多而導致其含量將少于酶活性較弱時的總多酚含量,因此,圖4所示的變化趨勢與圖2中總多酚含量的變化趨勢是相符合的,即酶活性越強,蘋果皮中總多酚含量越少,反之越多。由于ALA能誘導細胞抗氧化反應[22],噴施了ALA的蘋果果皮中PPO活性受到了抑制,所以ALA處理果的PPO活性低于GNT處理果。至于為什么A+G處理果的PPO活性高于單獨的ALA或GNT的處理果,還需要進一步進行實驗加以研究。

圖4 不同蘋果果皮顏色對PPO酶活性的影響Fig.4 Different color of apple peel impact on PPO enzyme activity

2.5 相關(guān)基因測定結(jié)果

2.5.1 PAL基因 PAL基因相對表達量的測定結(jié)果如圖5所示,隨著蘋果果皮顏色逐漸變淺,其基因相對表達量減小。其中完全套袋處理的蘋果基因表達量最小,說明避光處理嚴重抑制了PAL基因的表達。另外,由圖可以看出用A+G、GNT、ALA處理過的蘋果果皮中PAL基因表達量均顯著高于對照組,這一變化趨勢與以上圖3中PAL酶活性的變化結(jié)果相一致,符合基因與酶的生物變化關(guān)系。

圖5 不同蘋果果皮顏色對PAL基因相對表達含量的影響Fig.5 Different color of apple peel impact on relative expression of PAL

2.5.2 CHS、CHI、ANR、FLS及MYB10基因 CHS、CHI、ANR、FLS及MYB10基因的相對表達量的測定結(jié)果如圖6所示,同樣地,隨著蘋果果皮顏色的逐漸變淺,其基因相對表達量呈現(xiàn)出減小趨勢,均為A+G處理過的蘋果果皮的基因相對表達量最高,完全套袋處理的蘋果果皮的基因相對表達量最低。這一結(jié)果與圖1蘋果皮中花青苷含量的變化趨勢是相一致的。

圖6 不同蘋果果皮顏色對五種基因相對表達含量的影響Fig.6 Different color of apple peel impact on relative expression of genes

以上結(jié)果中,果皮多酚的變化規(guī)律、PAL酶活性變化規(guī)律和PAL基因表達變化規(guī)律三者相吻合,果皮花青苷的變化規(guī)律和相關(guān)基因表達變化規(guī)律相吻合,這與前人的研究規(guī)律相同[18,23-24],并再次驗證了“基因控制酶的合成,酶控制產(chǎn)物的合成”這一生物學規(guī)律。

3 結(jié)論

ALA和GNT混合使用,具有協(xié)同作用,以尋求蘋果著色最高效的方法,從實驗結(jié)果也可以看出,就蘋果著色而言,在蘋果摘袋后ALA和GNT混合作用,對蘋果進行連續(xù)噴施處理有利于果皮中花青苷的積累,使蘋果在采收時具有良好的色澤,極大地提高了蘋果果實外觀品質(zhì),因此可用于人工控制早、中熟蘋果著色,改善早、中熟蘋果著色效果,從而提高其市場競爭力,這對實際生產(chǎn)有極大的實用意義。

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Effect of 5-Aminolevulinic acid and Genistein on thepolyphenols,enzyme activity and gene expression in apple skin

BAI Ge,GUO Yu-rong*,CHEN Lei

(College of Food Engineering and Nutrition Science,Shaanxi Normal University,Xi’an 710119,China)

Objective:To explore the changes of total polyphenol,anthocyanin,enzymes activity and gene expression in apple skin when the apples were spraied by 5-Aminolevulinic acid(ALA)and Genistein(GNT).Methods:During the field experiments,300mg·L-1ALA,21.62μg·L-1GNT,and ALA+GNT were used to spray the ‘Qinyang’ apple when debagged,and determined the total polyphenol,anthocyanin,enzymes activity and gene expression in apple skin.Results:The red of apple skin deepen as the increase of anthocyanin content and relative gene expression quantity. The total polyphenol content reached the highest and polyphenol oxidase(PPO)activity was lowest in which apple skin was spraied by ALA. The phenylalanin ammonia-lyase(PAL)activity was not significant in the apples treated with GNT and ALA,but higher than the other three kinds of apples.Conclusion:ALA and GNT were conductive to the anthocyanin accumulation,so they can be used for promoting the coloration of early apples to improve market competitiveness.

5-Aminolevulinic acid;Genistein;polyphenol;enzyme activity;gene expression

2014-08-25

白鴿(1992-),女,碩士研究生,研究方向:食品功能成分開發(fā)及利用。

*通訊作者:郭玉蓉(1962-),女,博士,教授,研究方向:食品化學。

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設專項資金資助(GK661001);中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金項目(GK261001330)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)13-0194-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.032