固定化苯丙氨酸脫氨酶拆分D,L-苯丙氨酸制備D-苯丙氨酸

房月芹,朱龍寶,黃 楠,周 麗,丁重陽,劉 穎,周哲敏,*

(1.江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院,江蘇無錫 214122;(2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122) (3.安徽工程大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000)

固定化苯丙氨酸脫氨酶拆分D,L-苯丙氨酸制備D-苯丙氨酸

房月芹1,朱龍寶2,3,黃 楠2,周 麗2,丁重陽2,劉 穎1,周哲敏2,*

(1.江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院,江蘇無錫 214122;(2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122) (3.安徽工程大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000)

為了建立新的D-苯丙氨酸生產(chǎn)工藝,對固定化苯丙氨酸解氨酶(PAL)拆分D,L-苯丙氨酸進(jìn)行了研究。以介孔材料(MCM-41)為載體固定PAL,將其用于拆分消旋體D,L-苯丙氨酸制備高光學(xué)純的D-苯丙氨酸。最佳的固定化條件是載酶量為50mg/g、殼聚糖濃度為0.1%(w/v)、戊二醛濃度為0.05%(v/v),固定化酶的活性達(dá)到最大,酶活保留達(dá)到92%,重復(fù)利用20次后,活性仍能保持85%。將制備的固定化酶應(yīng)用于D,L-苯丙氨酸的拆分,反應(yīng)24hL-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到98%,D-苯丙氨酸的ee值達(dá)到96%,且連續(xù)拆分10個(gè)批次后固定化酶對L-苯丙氨酸的轉(zhuǎn)化率仍保持在95%以上。因此,高效穩(wěn)定的固定化PAL在拆分D,L-苯丙氨酸生產(chǎn)D-苯丙氨酸中具有良好的應(yīng)用前景。

苯丙氨酸脫氨酶,介孔材料MCM-41,固定化,D,L-苯丙氨酸拆分

D-苯丙氨酸能增強(qiáng)人體免疫功能,具有出色的鎮(zhèn)痛作用,常用做抗腫瘤藥物、糖尿病治療藥物及HIV蛋白酶抑制劑的生產(chǎn)原料。目前通常采用不對稱化學(xué)合成法[1-2]、氨基酰化酶法[3]、海因酶法[4]等方法制備。這些方法都有一定的局限性,其中不對稱化學(xué)合成法采用的手性助劑來源有限,價(jià)格昂貴;氨基?；阜ㄐ枰獙Φ孜镞M(jìn)行乙?；?工藝路線長;海因酶法反應(yīng)步驟多,產(chǎn)物分離復(fù)雜。

PAL特異性催化L-苯丙氨酸分解為反式肉桂酸和氨[5],應(yīng)用于合成芳香丙氨酸和治療苯丙酮尿癥[6]。在工業(yè)應(yīng)用方面鮮有報(bào)道,僅黃建坡等采用固定化粘紅酵母細(xì)胞法生產(chǎn)D-苯丙氨酸[7]。但由于在粘紅酵母細(xì)胞內(nèi)PAL的表達(dá)量較低,且固定化細(xì)胞在催化反應(yīng)時(shí)底物和產(chǎn)物進(jìn)出細(xì)胞會(huì)受到傳質(zhì)阻力,所以轉(zhuǎn)化速率較低。本實(shí)驗(yàn)室前期已克隆了來源于粘紅酵母的PAL基因,并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá),該酶熱穩(wěn)定性高,pH耐受性好,非常適用于工業(yè)應(yīng)用[8]。

介孔二氧化硅如MCI-41由于具有大比表面積和孔徑率,高機(jī)械強(qiáng)度、表面具有活性基團(tuán)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用作固定化材料[9-10]。MCM-41孔徑在1～30nm,與自然界大部分酶的直徑相近,酶能進(jìn)入介孔材料孔道內(nèi)[11-12]。由于酵母PAL的直徑在10nm內(nèi)[13],因而選擇孔徑為2～12nm的MCM-41作為載體,酶不僅能進(jìn)入孔道內(nèi),而且孔徑越小,比表面就越大,酶的裝載量就越大。本文以介孔材料MCM-41為載體,采用了一種簡單有效的吸附后交聯(lián)方法[14]對PAL進(jìn)行固定化。并用固定化酶對D,L-苯丙氨酸進(jìn)行拆分制備D-苯丙氨酸,初步探索了D-苯丙氨酸生產(chǎn)的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PAL為本實(shí)驗(yàn)室自制[8];介孔分子篩MCM-41、殼聚糖、戊二醛、D,L-苯丙氨酸、Bradford蛋白濃度測定液均為市售分析純試劑。

大容量冷凍離心機(jī) 日本日立;超聲波細(xì)胞破碎儀 日本索尼公司;HPLC 日本日立;培養(yǎng)箱和搖床 博迅實(shí)業(yè)有限公司

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PAL的固定化 在5mL蛋白濃度為0.5mg/mL的PAL溶液中(用0.05mol/L、pH8.5 Tris-HCl緩沖液配制),加入50mg介孔材料MCM-41,置于15℃的恒溫震蕩器(200r/min)吸附4h,所得固定化酶用緩沖液洗凈后加入終濃度為0.1%(w/v)的殼聚糖溶液,持續(xù)攪拌2h并用緩沖液洗凈后重懸于緩沖液中,最后以體積分?jǐn)?shù)為0.05%(v/v)的戊二醛溶液于4℃下交聯(lián)固定化酶1h[9-10]。

1.2.2 吸附量和酶活的測定 用Bradford法分別測定吸附前酶液中和吸附后上清中的蛋白濃度,蛋白量之差為固定化酶的吸附量。在反應(yīng)體系中加入與游離酶等蛋白量的固定化酶按照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行酶活測定。

酶活保留(%)=固定化酶酶活/游離酶酶活×100

相對酶活(%)=固定化酶酶活/固定化酶的最高酶活×100

1.2.3 固定化PAL的性質(zhì) 在反應(yīng)條件為45℃,pH8.5下對固定化酶的酶活進(jìn)行20次重復(fù)測定,研究其操作穩(wěn)定性。

1.2.4 固定化PAL拆分D,L-苯丙氨酸 將含有30mg PAL的固定化酶加入1L D,L-苯丙氨酸溶液中(D-苯丙氨酸和L-苯丙氨酸各50mmol/L,pH8.5),在45℃下攪拌反應(yīng),每隔3h取出0.1mL反應(yīng)液,測定其中L-苯丙氨酸的含量,反應(yīng)24h后結(jié)束轉(zhuǎn)化過程。

1.2.5 轉(zhuǎn)化率的測定 拆分反應(yīng)中取出的反應(yīng)液按照文獻(xiàn)[15]測定其中D-苯丙氨酸和L-苯丙氨酸的含量,計(jì)算出L-苯丙氨酸的轉(zhuǎn)化率。

轉(zhuǎn)化率=(C0-Ci)/C0×100%

式中：Ci:第i次所取反應(yīng)液中L-苯丙氨酸的濃度;C0:轉(zhuǎn)化前D,L-苯丙氨酸溶液中L-苯丙氨酸的濃度。

式中：D表示D-phe的濃度;L表示L-phe的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 MCM-41的載酶量

從圖1可以看出,當(dāng)載酶量為50mg/g時(shí),固定化酶的相對酶活最高。載酶量對相對酶活的影響與介孔分子篩MCM-41的通道大小有關(guān),當(dāng)介孔材料MCM-41的孔道被酶分子所飽和時(shí),固定化酶活性達(dá)到最大;當(dāng)載酶量較小時(shí),酶分子為了能夠獲得對載體孔道和表面的最大接觸,會(huì)發(fā)生變形和伸展而導(dǎo)致構(gòu)象變化,引起酶活損失[15];而當(dāng)載酶量超過最適載量后,又會(huì)使通道內(nèi)阻塞,底物難以進(jìn)入通道,只能與載體表面所固定的酶分子反應(yīng),相對活力不增反降。

圖1 載酶量對固定化酶相對酶活的影響Fig.1 Effect of loading amount on relative activity of immobilized enzyme

2.2 殼聚糖濃度對固定化酶的影響

由圖2可知,當(dāng)殼聚糖濃度為0.1%(w/v)時(shí),固定化酶的相對酶活最高;隨著殼聚糖濃度進(jìn)一步升高,相對酶活開始下降。因?yàn)樵跉ぞ厶菨舛葹?.1%(w/v)時(shí),既能夠保證酶分子不發(fā)生滲漏又不至于形成過于致密的網(wǎng)狀層阻礙底物與產(chǎn)物的進(jìn)出,固定化酶的酶活才能達(dá)到最高。

圖2 殼聚糖濃度對固定化酶的影響Fig.2 Effect of chitosan concentration on relative activity of immobilized enzyme

2.3 戊二醛濃度對固定化酶的影響

由圖3可知,在戊二醛濃度較低時(shí),相對酶活隨著戊二醛濃度的升高而升高,在戊二醛濃度為0.05%(v/v)時(shí),相對酶活最高;此后,固定化酶的相對酶活隨著戊二醛濃度升高而迅速降低。這是由于戊二醛的主要作用是交聯(lián)殼聚糖層,在濃度較低時(shí),不能形成穩(wěn)定的殼聚糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),固定化酶不穩(wěn)定有酶滲漏的情況發(fā)生[10],導(dǎo)致相對酶活較低;但是,過量的戊二醛又會(huì)過度交聯(lián)酶分子,使酶活降低。因此,固定化PAL的最佳條件確定為:載酶量為50mg/g,殼聚糖溶液濃度為1%(w/v),戊二醛溶液濃度為0.05%(v/v)。

圖3 戊二醛濃度對固定化酶的影響Fig.3 Effect of glutaraldehyde concentration on relative activity of immobilized enzyme

2.4 固定化PAL的性質(zhì)

在工業(yè)生產(chǎn)中,固定化酶的操作穩(wěn)定性高就能增加其在催化反應(yīng)中的重復(fù)使用次數(shù),是節(jié)約成本的重要條件[16]。圖4顯示的是固定化PAL的操作穩(wěn)定性。在20次催化反應(yīng)后固定化酶的酶活僅比初始酶活下降了15%,比Cui[17]等制備的固定化PAL有明顯的提高。以MCM-41為載體,通過先吸附后交聯(lián)制備的固定化PAL之所以能有較高的穩(wěn)定性,可能是由MCM-41獨(dú)特的有序介孔結(jié)構(gòu)及殼聚糖與戊二醛交聯(lián)所形成的堅(jiān)固網(wǎng)狀層決定的,有序介孔結(jié)構(gòu)能保證酶分子的均勻分布而外層的網(wǎng)狀層則有效地阻止酶分子的滲漏[9-10]。這些結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)制備的固定化酶在性質(zhì)上符合工業(yè)應(yīng)用所需。

圖4 固定化酶的操作穩(wěn)定性Fig. 4 The operational stability of the immobilized enzyme

2.5 拆分反應(yīng)的效率

將上述制備的固定化酶應(yīng)用于拆分D,L-苯丙氨酸(D-苯丙氨酸和L-苯丙氨酸各0.05mol/L,pH8.5),結(jié)果如圖5所示?？梢?在反應(yīng)的前12h L-苯丙氨酸的轉(zhuǎn)化率迅速上升到78%;而此后拆分反應(yīng)的轉(zhuǎn)化速率越來越慢,反應(yīng)24h后,轉(zhuǎn)化率達(dá)到98%以上。轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間變化的規(guī)律,可以由拆分反應(yīng)中的產(chǎn)物抑制作用來解釋。在反應(yīng)前期,生成的反式肉桂酸的量很少,L-苯丙氨酸濃度高,反應(yīng)速率大,L-苯丙氨酸的轉(zhuǎn)化率迅速上升;隨著底物中L-苯丙氨酸被大量地轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸,高濃度的反式肉桂酸嚴(yán)重抑制拆分反應(yīng)的進(jìn)行,從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化12h后轉(zhuǎn)化率增加的速率顯著下降;直至反應(yīng)24h,底物中L-苯丙氨酸幾乎被轉(zhuǎn)化完全,轉(zhuǎn)化率到達(dá)98%以上,可視為拆分反應(yīng)已經(jīng)完成。所以,實(shí)驗(yàn)中將24h定為拆分反應(yīng)的終點(diǎn)。

圖5 固定化酶拆分反應(yīng)的效率Fig. 5 The chiral resolution efficiency of the immobilized enzyme

2.6 底物濃度對拆分效率的影響

底物濃度不僅是判斷反應(yīng)效率的重要參數(shù),同時(shí)還會(huì)影響拆分效率。表1顯示的是不同D,L-苯丙氨酸濃度下的固定化酶拆分效率。由表可知,在濃度較低時(shí),固定化酶將D,L-Phe中的L-Phe完全轉(zhuǎn)化所需時(shí)間和轉(zhuǎn)化效率不同,隨著濃度的增加,拆分效率越來越高,在接近D,L-Phe飽和濃度[18]時(shí),效率達(dá)到最高為每小時(shí)轉(zhuǎn)化2.08mmol L-Phe。

表1 不同底物濃度下的拆分效率Table 1 Effect of different concentration of D,L-Phe on the chiral resolution efficiency

從工業(yè)制備的規(guī)模和效率上綜合考慮,高底物濃度下的拆分反應(yīng)有利于節(jié)約成本,所以本實(shí)驗(yàn)選擇100mmol/L的D,L-Phe進(jìn)行反應(yīng)。

2.7 拆分反應(yīng)的批次穩(wěn)定性

批次穩(wěn)定性是衡量工藝是否可行的重要條件。圖6顯示的是固定化PAL拆分D,L-苯丙氨酸的批次穩(wěn)定性。由圖可知,固定化酶在連續(xù)進(jìn)行10個(gè)批次拆分反應(yīng)的過程中始終能夠?qū)-苯丙氨酸的轉(zhuǎn)化率保持在95%以上的水平。

圖6 固定化酶拆分的批次穩(wěn)定性Fig. 6 The batch stability of the immobilized enzyme

3 結(jié)論

利用介孔分子篩MCM-41、殼聚糖、戊二醛采取先吸附后交聯(lián)的方法固定化PAL,經(jīng)過條件優(yōu)化得到了酶活保留高達(dá)92%、穩(wěn)定性良好的固定化酶。將固定化PAL用于催化拆分D,L-苯丙氨酸的反應(yīng)中,固定化酶的操作穩(wěn)定性高,在連續(xù)10個(gè)批次的拆分反應(yīng)后,轉(zhuǎn)化率始終保持在95%以上。因此,固定化PAL拆分D,L-苯丙氨酸為D-苯丙氨酸高效制備提供了新方法。

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Chiral resolution ofD,L-phenylalanineusing immobilized phenylalanine ammonia-lyase for production ofD-phenylalanine

FANG Yue-qin1,ZHU Long-bao2,3,HUANG Nan2,ZHOU Li2,DING Zhong-yang2,LIU Ying1,ZHOU Zhe-min2，*

(1.School of Environment and Civil Engineering,Jiangnan University,Wuxi 214122,China；2.School of Biotechnology,Jiangnan University,Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Wuxi 214122,China；3.School of Biochemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

In order to establish a new method for the production of D-phenylalanine,the chiral resolution of D,L-phenylalanine using immobilized phenylalanine ammonia lyase(PAL)was investigated. The mesoporous silica materials MCM-41 was used as support. Under the optical immobilization conditions,a maximum activity of PAL was 92% of the free enzyme. The reusability of immobilized enzyme retained 85% activity after 20 cycles. Using the immobilized PAL to catalyze resolution of D,L-phenylalanine,a 98% conversion ratio of L-phenylalanine was attained within 24h,and the enantiomeric excess value of D-phenylalanine attained 96%. The immobilization enzyme ran continuously for 10 batches,the conversion ratio retained above 95%. Therefore,the immobilized PAL showed commercial application for the production of D-phenylalanine from chiral resolution of D,L-phenylalanine.

phenylalanine ammonia lyase(PAL);MCM-41;immobilization;chiral resolution of D,L-phenylalanine

2014-07-23

房月芹(1969-)，女，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：分子生物學(xué)。

*通訊作者:周哲敏(1969-)，男，博士，教授，研究方向：酶工程與技術(shù)。

工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)開發(fā)課題(KLIB-KF201107,KLIB-KF201203)。

TS255.1

B

1002-0306(2015)11-0243-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.041