曲酸對菠蘿蜜多酚氧化酶的抑制作用和抑菌實驗

何世微,陶毅明,王貴平,廖朝亮

(桂林醫(yī)學院 生物技術學院,廣西桂林 541004)

曲酸對菠蘿蜜多酚氧化酶的抑制作用和抑菌實驗

何世微,陶毅明*,王貴平,廖朝亮

(桂林醫(yī)學院 生物技術學院,廣西桂林 541004)

采用酶動力學和Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖研究了曲酸對菠蘿蜜多酚氧化酶PPO的抑制作用和機理,并通過平板菌落實驗研究了曲酸對果肉的抑菌效果。結果表明,曲酸對PPO酶活有很強的抑制作用,其IC50為0.297mmol/L,表現(xiàn)為可逆非競爭性抑制,解離常數(shù)Ki為0.296mmol/L;果肉經(jīng)0.10%曲酸浸泡后6d內具有較好的抑菌效果。

曲酸,菠蘿蜜,多酚氧化酶,抑制作用,抑菌

菠蘿蜜(Artocarpusheterophyllus),又名樹菠蘿,屬熱帶水果,在我國海南、福建、廣東和廣西等地廣泛栽培,其果肉口感爽脆、蜜甜,富含糖類、蛋白質、維生素及各種有益微量元素,營養(yǎng)價值高[1]。菠蘿蜜果實碩大,果殼所占體積較大,因此常以鮮切果肉、果脯等形式出售。菠蘿蜜加工過程中,細胞受損,在多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)的催化下,果肉中的酚類物質被氧化成褐色或黑色的醌類物質,使果肉顏色加深,從而影響到產(chǎn)品的外觀。菠蘿蜜的護色保鮮研究工作較少,其方式主要有抗壞血酸浸泡[2]、殼聚糖涂膜[3]和復合配方浸泡[4]等。但這些方法存在某些缺點,如抗壞血酸可參與非酶促褐變、糖類涂膜容易滋生細菌、復合配方中添加劑種類多、成本高。因此使用單一、安全、有效、廉價兼抑菌的褐變抑制劑對菠蘿蜜果肉進行保鮮研究具有現(xiàn)實意義。曲酸是微生物產(chǎn)生的一種弱酸性代謝物,也是目前在果蔬和食品行業(yè)中使用的一種天然保鮮劑,可抑制PPO酶活并具抑菌作用[5]。本文研究了曲酸對菠蘿蜜PPO的抑制作用和機理,并觀察了曲酸的實際抑菌效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菠蘿蜜 桂林當?shù)厥袌鲑徺I的成熟菠蘿蜜,果實色澤亮黃、香氣濃郁、肉肥味甜;DEAE Sepharose Fast Flow、Sephacryl S-200 美國GE公司;曲酸 分析純,成都艾科試劑公司;兒茶酚 分析純,上海生工生物公司。

1510酶標儀 美國Thermo Fisher公司;3K15低溫離心機 德國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶的分離純化 稱取20g菠蘿蜜果肉,置于100mL預冷的0.1mol/L磷酸緩沖液中(PBS,pH7.0,含0.5%聚乙烯吡咯烷酮和少量二氧化硅),于冰上研磨,4℃靜置過夜。次日研磨液4℃、10000r/min離心15min,保留上清液,用-20℃預冷的丙酮在冰鹽浴下(-15℃)沉淀蛋白質。-20℃靜置2h后,10000r/min,4℃離心15min,收集沉淀。蛋白質沉淀用4mL PBS重新溶解后,經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析和Sephacryl S-200分子篩層析,最后得到純化的PPO[6]。

1.2.2 酶活及反應初速率的測定 25℃條件下,300μL無曲酸測活體系中含50μL 0.2mol/L PBS(pH7.0)、150μL 50mmol/L兒茶酚、50μL酶液和50μL蒸餾水。反應時觀察黃色產(chǎn)物鄰醌的生成,1min后(直線范圍內即反應初速率范圍)測吸光值A420。每分鐘吸光值增加0.001定義為一個酶活單位(U)[6]。反應初速率v以每分鐘酶活單位的變化來表示,單位為U/min。

1.2.3 IC50的測定 在反應管中加入50μL 0.2mol/L PBS(pH7.0)、150μL 50mmol/L兒茶酚、3～30μL 10mmol/L曲酸母液和50μL酶液,并用蒸餾水補足至300μL,得到含不同曲酸濃度(0.1～1.0mmol/L)的反應體系。反應1min后測A420。以無曲酸測活體系中的酶活定為100%。IC50(即抑制50%酶活的曲酸濃度)通過軟件SPSS 15.0回歸分析求得。

1.2.4 可逆抑制的判定 在含不同濃度曲酸(0、0.1、0.2、0.4、0.6mmol/L)的測活體系中,固定兒茶酚濃度為25mmol/L,改變酶的加入體積,加入10～50μL 180μg/mL酶液,并用蒸餾水補足至300μL,得到含不同酶濃度(6～30μg/mL)的反應體系。測定各體系v?？赡嬉种茷橐唤M通過原點的直線。

1.2.5 解離常數(shù)的測定 在含不同濃度曲酸(0、0.1、0.2、0.5mmol/L)的測活體系中,改變底物兒茶酚的加入體積,加入30～120μL 50mmol/L兒茶酚,并用蒸餾水補足至300μL,得到含不同底物濃度(5～20mmol/L)的反應體系。測定各體系v。以初速率的倒數(shù)1/v對底物濃度的倒數(shù)1/[S]作圖,即Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖,得到一組直線。對于非競爭性抑制,以該組直線的各縱截距1/Vm對曲酸濃度二次作圖,得一直線,其斜率為1/Vm0Ki,式中Ki為解離常數(shù),Vm0為雙倒數(shù)作圖中對照(即不含曲酸的直線)的縱截距[7]。

1.2.6 PPO在曲酸溶液中的反應進程曲線 在含不同濃度曲酸(0、0.1、0.2、0.3、0.8mmol/L)的測活體系,觀察黃色產(chǎn)物鄰醌隨時間的生成過程,每隔30s測A420,共測10min,以A420對時間作圖[8]。

1.2.7 平板菌落計數(shù) 果肉經(jīng)0%、0.05%和0.10%(w/v)曲酸溶液浸泡15min后,置8℃冰箱儲藏。在處理當天(第0d,即浸泡后不儲藏立即菌落培養(yǎng)48h)和儲藏第3、6、9d,無菌操作分別取25g樣品,放入裝有225mL 0.86% NaCl的滅菌均質杯內,于8000r/min均質2min,制成樣品勻液。勻液經(jīng)104～106倍稀釋后,接種在瓊脂平板上,36℃培養(yǎng)48h后計數(shù)。結果以每克果肉上菌落形成單位(colony-forming unit,CFU)的常用對數(shù)表示,即lgCFU/g表示[9]。

2 結果與討論

2.1 曲酸對PPO的抑制作用

不同濃度曲酸對PPO酶活的影響如圖1，0.1～0.4mmol/L范圍內,PPO酶活隨著曲酸濃度增大迅速下降;在0.6～1.0mmol/L范圍內,PPO酶活緩慢下降,表現(xiàn)出殘余酶活,IC50為0.297mmol/L。曲酸對菠蘿蜜PPO的抑制效果弱于對蘑菇PPO(IC50=0.18mmol/L)[10]的抑制效果。曲酸抑制PPO酶活可能與以下因素有關[11]:與酶結合,阻礙酶與底物結合;螯合酶活中心的銅離子;干擾酶促反應中氧的參與;將產(chǎn)物醌重新還原成酚。

圖1 曲酸對PPO酶活的影響Fig.1 Effect of kojic acid on PPO activity

2.2 曲酸對PPO的抑制為可逆抑制

不同曲酸濃度下,反應初速率v對酶濃度作圖,得到一組經(jīng)過原點的直線(圖2),直線的斜率低于對照(0mmol/L),且隨曲酸濃度的增加而降低。依動力學規(guī)律可知,曲酸對PPO的抑制作用是可逆過程(若為不可逆抑制,則為一組不通過原點的直線,且向右平移)[7],這說明曲酸與PPO以非共價鍵結合,結合較弱。

圖2 不同曲酸濃度下，酶濃度對酶活的影響Fig.2 Effect of PPO concentration on its activity at different concentrations of kojic acid

2.3 曲酸對PPO的抑制為非競爭性抑制

在不同濃度曲酸溶液中,改變底物兒茶酚濃度[S],以1/v對1/[S]雙倒數(shù)作圖(圖3a),得到一組橫截距相同,縱截距不同的直線。說明曲酸不影響米氏常數(shù)(Km),只影響最大反應速率(Vm),表現(xiàn)為非競爭性抑制?？赏茰y在菠蘿蜜PPO活性中心外,存在與曲酸相結合的調節(jié)位點,曲酸與該調節(jié)位點結合后,改變PPO酶活中心構象從而影響酶活性的大小。在非競爭性抑制中,PPO與底物結合后,可再與曲酸結合,PPO與曲酸結合后也可與底物繼續(xù)結合,可以形成酶-底物-抑制劑三元復合物(ESI)。由于不同來源的PPO結構上存在差異,曲酸對PPO可表現(xiàn)為不同的抑制機理,如曲酸對茄子PPO[12]和里氏木霉(Trichodermareesei)PPO[13]表現(xiàn)為競爭性抑制。在這類抑制中,曲酸與酶活中心結合,所以底物就不能再與酶結合,即曲酸和底物之間存在競爭關系。

以1/Vm對曲酸濃度二次作圖(圖3b),求得曲酸與菠蘿蜜PPO的解離常數(shù)Ki為0.296mmol/L,低于與小麥PPO的Ki(0.6mmol/L)[14],高于與茄子PPO的Ki(0.123mmol/L)[12]和里氏木霉(Trichoderma reesei)PPO的Ki(0.01mmol/L)[13]。解離常數(shù)Ki越小,說明抑制劑與酶結合越牢固,其抑制作用越強。

圖3 曲酸與PPO解離常數(shù)的測定Fig.3 Determination of Ki of kojic acid and PPO注：a:不同濃度曲酸1/v對1/[S]作圖； b:1/Vm對曲酸濃度作圖。

2.4 PPO在曲酸溶液中的反應進程曲線

PPO在曲酸溶液中的酶促反應過程如圖4:隨著曲酸濃度的增加,酶活逐漸降低。隨著反應時間的延長,進程曲線的斜率不斷下降,最后趨近于一條直線(圖4虛線),即達到最大反應速率Vm。Vm隨著曲酸濃度的增加而降低。曲酸抑制菠蘿蜜PPO的酶促反應無遲滯現(xiàn)象,與硫脲對槐尺蠖PPO的抑制過程相似[8],而在里氏木霉(Trichodermareesei)[13]和舞毒蛾(Lymantriadispar)PPO[15]酶促反應中,曲酸能顯著延長遲滯時間,使產(chǎn)物的開始生成時間延后。

圖4 PPO在不同濃度曲酸溶液中的反應進程曲線Fig.4 Progress curves of PPO in different concentrations of kojic acid

2.5 曲酸對菠蘿蜜果肉的抑菌效果

平板菌落實驗結果表明(圖5):處理當天(第0d,即浸泡后不儲藏立即菌落培養(yǎng)48h),瓊脂平板(0%、0.05%和0.10%曲酸)的菌落數(shù)分別為6309、398和100CFU/g,表明曲酸浸泡處理15min即可殺死果肉表面的絕大多數(shù)細菌,菌落總數(shù)只有對照的1.5%～6.3%。從第0d到第9d,經(jīng)0.05%和0.10%曲酸浸泡的果肉,菌落數(shù)均明顯小于當天對照,差異顯著(p<0.05),說明曲酸能顯著抑制果肉上細菌繁殖。第6d,0.05%曲酸處理后菌落數(shù)與第0d對照接近,差異不顯著(p>0.05),0.10%曲酸處理后菌落數(shù)仍明顯少于第0d對照(p<0.05)。隨著天數(shù)的增加,特別是第9d,果肉即使經(jīng)過曲酸浸泡,菌落數(shù)目也明顯增加,達到105～106CFU/g,與第0d對照相比,差異顯著(p<0.05),說明曲酸的抑菌效果在6d內最好。曲酸可顯著抑制大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的生長,這可能與曲酸形成的酸性環(huán)境和抑制DNA復制相關酶有關[5,16]。

圖5 曲酸對菠蘿蜜果肉的抑菌作用Fig.5 Antibacterial effect of kojic acid on jackfruit bulbs注：字母不同的組間差異顯著(p<0.05)。

3 結論

曲酸對菠蘿蜜PPO酶活有較強抑制作用,IC50為0.297mmol/L。曲酸對PPO表現(xiàn)為可逆非競爭性抑制,解離常數(shù)Ki為0.296mmol/L。0.10%曲酸對鮮切菠蘿蜜有較好的抑菌效果,其抑菌效果在6d內最好。

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Inhibitory effect of kojic acid on polyphenol oxidase from jackfruit and its antibacterial experiment

HE Shi-wei,TAO Yi-ming*,WANG Gui-ping,LIAO Chao-liang

(College of Biotechnology,Guilin Medical University,Guilin 541004,China)

The inhibitory effect and mechanism of kojic acid on polyphenol oxidase(PPO)from jackfruit were studied by enzyme kinetics and Lineweaver-Burk plots. The antibacterial effect of kojic acid on jackfruit bulbs was tested by plate counting. The results showed that kojic acid significantly inhibited the enzyme activity,with an IC50of 0.297mmol/L. Kojic acid was a reversible non-competitive inhibitor,with the Kiof 0.296mmol/L. Jackfruit bulbs dipped in 0.10% kojic acid showed good antibacterial effect within 6d.

kojic acid;jackfruit;polyphenol oxidase;inhibitory effects;antibacterial

2014-07-23

何世微(1991-)，男，本科在讀，研究方向：酶學。

*通訊作者:陶毅明(1981-)，男，博士，副教授，研究方向：酶學。

國家自然科學基金(31260214)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)11-0159-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.023