一株產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶菌株的分離、鑒定及其tgl的克隆表達(dá)

張瑩瑩,石 楠,2,杜萍萍,申培立,李志輝,于宏偉,盧海強(qiáng),蘇旭東,張 偉,檀建新,*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)中心,河北保定 071001;2.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北保定 071002)

一株產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶菌株的分離、鑒定及其tgl的克隆表達(dá)

張瑩瑩1,石 楠1,2,杜萍萍1,申培立1,李志輝1,于宏偉1,盧海強(qiáng)1,蘇旭東1,張 偉1,檀建新1,*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)中心,河北保定 071001;2.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北保定 071002)

用稀釋平板法從土壤樣品中分離到166株細(xì)菌菌株,通過凝膠法初篩和Folk比色法復(fù)篩,得到一株產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase,TGase)的菌株,通過形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rDNA序列比對(duì)證明該菌株是枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),命名為TGase1318?？寺×嗽摼闠Gase的編碼基因tgl,序列長738bp,編碼由245個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì);TGase的氨基酸序列與NCBI公布的B.subtilis的TGase相似性達(dá)94%～100%。用B.subtilis表達(dá)載體pTZ和E.coli表達(dá)載體pET21b分別構(gòu)建了含tgl的重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化B.subtilisWB800和E.coliBL21,tgl基因表達(dá)產(chǎn)物在70℃下可催化BSA交聯(lián),表明tgl在B.subtilis和E.coli中獲得了表達(dá)且表現(xiàn)出TGase活性,這為其在食品工業(yè)上的開發(fā)利用打下基礎(chǔ)。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶,枯草芽孢桿菌,克隆和表達(dá),16S rDNA

谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(Transglutaminase,簡稱TGase,EC2. 3. 2. 13)是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的酶。它以肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基作為酰基供體,?；荏w可以是多肽鏈中賴氨酸殘基的ε-氨基、伯胺基或水。通過催化食品中的蛋白質(zhì)的交聯(lián)反應(yīng),從而改善其凝膠性、黏度、乳化性等物理性質(zhì),在食品加工過程中有廣泛應(yīng)用[1]。谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶存在于動(dòng)物、植物和微生物中,相對(duì)于動(dòng)、植物來源的TGase的分離、提取、純化工藝復(fù)雜、回收率低、成本過高等缺點(diǎn),微生物源的TGase可通過發(fā)酵法制備,具有產(chǎn)量高、易回收、成本低、不受季節(jié)限制等優(yōu)點(diǎn),更適合工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用[2]。

利用生物技術(shù)將編碼TGase的基因克隆并在適當(dāng)受體微生物中表達(dá),是提高TGase產(chǎn)量的有效途徑。目前,微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(Microbial transglutaminase,MTG)表達(dá)的研究主要集中在對(duì)放線菌的tgl基因的克隆與表達(dá)上[3-5]。Kikuchi[6]等人利用Corynebacterium glutamicum構(gòu)建了分泌型表達(dá)質(zhì)粒,可以直接表達(dá)具有酶活性的TGase,通過優(yōu)化發(fā)酵條件,使產(chǎn)量達(dá)到142mg/mL。有關(guān)枯草芽孢桿菌TGase的報(bào)道不少,但主要集中于TGase在芽孢形成時(shí)促進(jìn)孢衣蛋白之間的交聯(lián)作用[7-8],而對(duì)tgl基因克隆和表達(dá)則鮮有報(bào)道[9]。鑒于芽孢的抗熱性,其TGase可能有較高的最適溫度,較放線菌來源的TGase可能更適合高溫條件下的食品加工。如果能夠通過基因工程的手段獲得高效表達(dá)源于Bacillus的TGase的重組菌株,則其將會(huì)在食品工業(yè)中起到重要的作用。

本研究從土壤中分離并篩選出產(chǎn)TGase的菌株,克隆了其tgl基因,導(dǎo)入了枯草芽孢桿菌和大腸桿菌進(jìn)行表達(dá),為提高TGase表達(dá)量提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土壤樣品 河北省保定地區(qū),取地表5～15cm之間的土壤,裝入無菌袋中4℃保存;E.coliBL21 購自寶生物工程(大連)有限公司;B.subtilisWB800,pET21b和pTZ表達(dá)載體 為本實(shí)驗(yàn)室保存;重組質(zhì)粒pET21b-tgl,pTZ-tgl和TGase表達(dá)菌株BL21-pET1b-tgl,WB800-pTZ-tgl 為本研究構(gòu)建;試劑CBZ-Gln-Gly、鹽酸羥胺、還原性谷胱甘肽、L-谷氨酸-γ-單羥肟酸 均購自Sigma公司,其余試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?質(zhì)粒提取試劑盒,膠回收試劑盒,pMD19-T載體和限制性內(nèi)切酶等分子生物學(xué)試劑 購自寶生物工程(大連)有限公司;PCR試劑、100bp marker(2000、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100bp)、1kb marker(10、8、6、5、4、3、2、1kb) 購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

紫外分光光度儀 上海光譜儀器有限公司;JY96-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司;DYY-8C電泳儀 北京六一儀器廠;BINDA 2020D凝膠成像系統(tǒng) 北京賓達(dá)英創(chuàng)科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基:胰蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L、NaCl 10.0g/L、瓊脂粉15.0g/L、蒸餾水1000mL,pH8.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨20.0g/L,可溶性淀粉20.0g/L、酵母粉2.0g/L、MgSO42.0g/L、KH2PO42.0g/L、K2HPO42.0g/L、蒸餾水1000mL,pH7.0

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)酶菌株的分離與篩選

1.3.1.1 細(xì)菌的分離、純化 利用稀釋涂布平板法[10]在LB平板上分離土壤樣品中的細(xì)菌,30℃下培養(yǎng)2～3d,根據(jù)菌落形狀、大小、顏色等特征進(jìn)行初步歸類,每一類隨機(jī)挑取單菌落劃線純化,并保存于4℃冰箱中備用。

1.3.1.2 初篩 將分離的菌種分別于LB液體培養(yǎng)基中活化后,轉(zhuǎn)接至含5mL發(fā)酵培養(yǎng)基的試管中,于30℃、200r/min培養(yǎng)6d后利用凝膠法初篩產(chǎn)酶菌株[11]。

1.3.1.3 復(fù)篩 對(duì)初篩選出的菌株用比色法進(jìn)行復(fù)篩,測定上清液的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活力。谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活力測定按照Folk的比色法[12]。終止反應(yīng)后,12000r/min離心,棄去沉淀,測上清夜在 525nm下的吸光度。一個(gè)MTG酶活單位(1U/mL)定義為37℃下1min催化1μmol底物CBZ-Gln-Gly生成其單羥肟酸產(chǎn)物所需的酶量。

1.3.2 菌株的鑒定

1.3.2.1 形態(tài)學(xué)觀察和生理生化實(shí)驗(yàn) 菌株鑒定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[13]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[14]進(jìn)行。

1.3.2.2 16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹 按文獻(xiàn)[15]提取菌株TGase1318基因組作為模板,用16S rDNA通用引物5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′/5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′擴(kuò)增16S rDNA。反應(yīng)體系為:2μL模板DNA,上下游引物各1μL,2×EsTaq MasterMix 10μL,H2O 6μL。PCR反應(yīng)條件:94℃、預(yù)變性10min,94℃變性45s、55℃退火45s、72℃延伸90s,30個(gè)循環(huán),72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取驗(yàn)證后由北京六合華大基因科技股份有限公司測序。將菌株TGase1318的16S rDNA序列經(jīng)GenBank的BLAST檢索進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,選取屬內(nèi)同源性較高的細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行遺傳距離計(jì)算,采用MEGA軟件的Neighbor-Joining模型和BioEdit軟件分析遺傳距離并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3Tgl的克隆、測序和序列比對(duì)

1.3.3.1Tgl的PCR擴(kuò)增和克隆 依據(jù)NCBI上已公布B.subtilis的TGase基因的起始序列,用DNAMAN設(shè)計(jì)引物,上游引物Tgl-5:5′-GCGGTCGAC ATGATTATTGTATCAGGAC-3′(下劃線為Sal I酶切位點(diǎn));Tgl-3:5′-TAAAGCTTTTAGCGGACG ATGCGGAAAAG-3′(下劃線為Hind Ⅲ 酶切位點(diǎn))。擴(kuò)增反應(yīng)體系為60μL:基因組DNA 2μL,引物(10μmol/L)各3μL,2×EsTaq MasterMix 30μL,ddH2O 22μL。PCR反應(yīng)條件:94℃、預(yù)變性10min,94℃變性40s,58℃退火40s,72℃延伸1min,25個(gè)循環(huán),72℃終延伸10min。將PCR產(chǎn)物克隆入p-MD-19T的SalI和Hind Ⅲ位點(diǎn)之間,測序。

1.3.3.2 蛋白序列分析 利用NCBI BLAST、DNAMAN軟件分析TGase1318氨基酸序列。利用歐洲分子生物學(xué)開放軟件包EMBOSS(European Molecular Biology Open Software Suite),在線調(diào)用pepstats后,輸入TGase1318的TGase氨基酸序列,得到其一級(jí)結(jié)構(gòu)和一些基本參數(shù)。用AntheProt軟件分析蛋白的等電點(diǎn)和蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu),分別預(yù)測其α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲的百分含量。利用Phyre2軟件對(duì)該菌株TGase進(jìn)行蛋白的保守域和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.3.3.3 重組質(zhì)粒pTZ-tgl和pET-21b-tgl的構(gòu)建 重組質(zhì)粒pTZ-tgl和pET21b-tgl的構(gòu)建步驟如圖1所示,用SalI和HindⅢ 雙酶切1.3.3.1中的tglPCR產(chǎn)物和載體pTZ、pET21b,經(jīng)酶切膠回收后的tgl基因片段分別與載體pTZ和pET21b連接,轉(zhuǎn)化E.coliJM109。將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為pTZ-tgl和pET21b-tgl。

圖1 表達(dá)載體pTZ-tgl和pET-21b-tgl的構(gòu)建流程簡圖Fig.1 Flow chart of the construction of expression vectors pET-21b-tgl and pTZ-tgl

1.3.3.4 重組質(zhì)粒在E.coliBL21和B.subtilisWB800中的轉(zhuǎn)化 取重組質(zhì)粒pTZ-tgl加入已制備好的B.subtilisWB800的感受態(tài)細(xì)胞[16-17]中,至終濃度約1μg/mL,37℃靜置1h后200r/min振蕩培養(yǎng)3h,轉(zhuǎn)化液涂布在含有紅霉素(10μg/mL)LB平板上,培養(yǎng)過夜。挑取陽性轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證后命名為WB800-pTZ-tgl。

將重組質(zhì)粒pET-21b-tgl用熱擊法轉(zhuǎn)化E. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含100μg/mL的氨芐青霉素LB平板上,經(jīng)37℃培養(yǎng),挑取陽性轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證后命名為BL21-pET21b-tgl。

1.3.4Tgl在E.coli和B.subtilis中的表達(dá)和BSA交聯(lián)反應(yīng) 將WB800-pTZ-tgl和BL21-pET21b-tgl分別轉(zhuǎn)接至20mL含有紅霉素(10μg/mL)或氨芐青霉素(100μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中,37℃、200r/min震蕩培養(yǎng)到OD600為0.5時(shí),分別加入終濃度為2%的D-Xylose和1mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),誘導(dǎo)24h后收集菌體。

將誘導(dǎo)后的WB800-pTZ-tgl發(fā)酵液離心收集上清作為粗酶液,參照1.3.1.3方法測定谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的活性;同時(shí)將60μL粗酶液與30μL BSA(1mg/mL)[18]于70℃保溫不同時(shí)間,取30μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

將培養(yǎng)的BL21-pET21b-tgl用IPTG(1mmol/L)誘導(dǎo)后收集菌體,重懸于1mL Tris-HCl(20μmol/L,pH8.0)緩沖液中超聲破碎制備成粗酶液,取400μL粗酶液按1.3.1.3測定TGase的活性;取20μL粗酶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳來判定表達(dá)產(chǎn)物的大小和多少;同時(shí)取60μL粗酶液與30μL BSA(1mg/mL)在70℃保溫不同時(shí)間,取20μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。以未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BL21-pET21b-tgl菌裂解液作為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株TGase1318的分離和鑒定

2.1.1 產(chǎn)TGase的芽孢桿菌的分離 經(jīng)稀釋平板法從土樣中分離到166株細(xì)菌,用酪蛋白凝膠反應(yīng)初篩得到55株細(xì)菌。將這些菌株經(jīng)搖瓶培養(yǎng)用比色法測定TGase的活性,篩選到一株酶活為0.11±0.04U/mL的菌株,與其他菌株相比,其活性最高,命名為TGase1318,以此為出發(fā)菌株作進(jìn)一步鑒定和異源表達(dá)分析。

2.1.2 菌株TGase1318的16S rDNA擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 以產(chǎn)酶菌株TGase1318的基因組DNA為模板擴(kuò)增16S rDNA得到長度約為1.5kb的DNA片段,1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。將16S rDNA擴(kuò)增片段測序,證明該片段長1487bp。將該序列與多個(gè)NCBI公布的芽孢桿菌屬的菌株16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì),用MEGA軟件構(gòu)建了基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2),由圖可知其16S rDNA序列與枯草芽孢桿菌(B. subtilis)的同源性高達(dá)99%以上,證明菌株TGase1318為B.subtilis。

圖2 菌株TGase1318的16S rDNA的 PCR產(chǎn)物及其系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 16S rDNA PCR product of the strain TGase1318 and its phylogenetic tree注：M：1kb Marker；1：16S rDNA PCR 產(chǎn)物。

2.1.3 菌株TGase1318的形態(tài)及生理生化特征 將菌株TGase1318在LB平板上培養(yǎng),菌落呈圓形,烏白色,表面干燥,粗糙不透明,邊緣不規(guī)則(圖3)。挑取單個(gè)菌落鏡檢,該菌株為革蘭氏陽性、直桿狀細(xì)菌,在營養(yǎng)條件貧乏或生長條件不利的情況下形成芽孢(圖3,箭頭所指為芽孢)。將菌株TGase進(jìn)行生理生化鑒定,結(jié)果見表1。從菌落特征、個(gè)體形態(tài)和生理生化鑒定結(jié)果可知,該菌株為枯草芽孢桿菌,與16S rDNA結(jié)果一致,因此確定菌株TGase1318為B.subtilis。

2.2 菌株TGase1318tgl基因的克隆和表達(dá)

2.2.1tgl基因的克隆 通過己知B.subtilis的tgl序列設(shè)計(jì)引物,以TGase1318基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)過擴(kuò)增后得到DNA條帶大小約740bp,PCR產(chǎn)物回收后用pMD-19克隆(圖4)。將tgl測序證明該基因編碼區(qū)全長738bp,與GenBank中已公布的B.subtilis的tgl基因序列比對(duì),同源性在93%～99%之間,該基因已在GenBank中注冊(cè)(Accession number:1742195)。

表1 TGase1318的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the strain TGase1318

注:+:陽性;-:陰性。

圖3 TGase1318在LB平板上的菌落形態(tài)、菌體及芽孢形態(tài)Fig.3 The morphology of cell, spore and colony of the strain TGase1318 on LB plate The arrow point to the spore of TGase1318 strain

圖4 菌株TGase1318的tgl基因的克隆Fig.4 cloning of tgl gene from TGase1318 strain注：1：tgl基因PCR產(chǎn)物； 2：經(jīng)Sal I/Hind III酶切后的 pMD-19T-tgl；M1：100bp Marker；M2:1kb Marker。

2.2.2tgl編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列及特性分析 由tgl基因序列推導(dǎo)出其編碼的TGase由245個(gè)氨基酸殘基組成,包括了20種常見的氨基酸,其中亮氨酸、異亮氨酸和丙氨酸含量最高,分別占11.43%、8.98%、7.76%。從氨基酸性質(zhì)看,該蛋白含57.55%的非極性氨基酸和42.45%的極性氨基酸,其中極性氨基酸中堿性氨基酸占13.47%,酸性氨基酸占11.43%。該蛋白分子量為28.29ku,預(yù)測的等電點(diǎn)為pI 6.71,為弱酸性蛋白。

根據(jù)氨基酸序列,基于GOR法預(yù)測的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)見圖5,其中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲分別占44%、14%、21%和21%,利用Phyre2軟件預(yù)測的TGase三級(jí)結(jié)構(gòu)見圖6,它有四個(gè)α-螺旋、兩個(gè)β-折疊,蛋白的保守區(qū)預(yù)測在蛋白質(zhì)的中后段,位于第110～197個(gè)氨基酸殘基區(qū)域。將氨基酸序列與NCBI公布的TGase進(jìn)行BLAST比對(duì),表明該蛋白與現(xiàn)有B.subtilis的TGase同源性高達(dá)94%～100%,說明B.subtilis的TGase具有極強(qiáng)的保守性;與其他芽孢桿菌屬的TGase相比,同源性多在54%～75%之間,如與B.vallismortis、B.amyloliquefaciens、B.pumilus同源性分別為91%、72%和54%。

圖5 tgl編碼蛋白TGase的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig.5 The secondary structure prediction of TGase encoded by tgl gene注：1：β-折疊；2：β-轉(zhuǎn)角；3：α-螺旋；4：無規(guī)則卷曲。

圖6 tgl編碼蛋白TGase的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig.6 The tertiary structure prediction of TGase1318 encoded by tgl gene

2.2.3 含tgl基因的表達(dá)載體pTZ-tgl和pET21b-tgl的構(gòu)建 克隆的tgl基因和分泌型穿梭表達(dá)載體pTZ、表達(dá)載體pET21b分別經(jīng)SalI和Hind Ⅲ雙酶切,回收后的tgl和載體連接后分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pTZ-tgl和pET21b-tgl(圖1),酶切分析結(jié)果證明兩個(gè)重組質(zhì)粒含有tgl基因(738bp)和pTZ(約8300bp)(或pET21b,約5440bp)載體,表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖7)。

圖7 含tgl基因表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.7 Construction of expression vectors (pET21b-tgl and pTZ-tgl) containing tgl gene注：M1：100bp Marker；M2：1kb Marker 1：經(jīng)Sal I/Hind II酶切后的pET21b-tgl； 2：經(jīng)Sal I/Hind III 酶切后的pTZ-tgl。

2.3 表達(dá)載體pTZ-tgl和pET21b-tgl在B.subtilisWB800和E. coli BL21中的誘導(dǎo)表達(dá)

將含分泌型表達(dá)載體pTZ-tgl的陽性菌株WB800-pTZ-tgl在含有紅霉素(10μg/mL)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.5時(shí),加入木糖誘導(dǎo)24h后離心收集上清,測定谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的活性。結(jié)果表明TGase酶活較低僅為0.16±0.04U/mL,與出發(fā)菌株相似,但是粗酶液與BSA反應(yīng)不同時(shí)間后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析,可以看出表達(dá)的TGase能使BSA交聯(lián),并隨時(shí)間延長交聯(lián)程度增大(圖8),說明該菌株表達(dá)且將TGase分泌到了培養(yǎng)基中。但是SDS-PAGE電泳分析發(fā)酵液,未發(fā)現(xiàn)明顯的TGase條帶,表明表達(dá)量較低。

圖8 TGase對(duì)BSA的交聯(lián)作用Fig.8 The crosslink of BSA catalyzed by TGase注：1～4：BL21-pET21b-tgl與BSA混合溫育0，1，3 and 6h； 5～9：WB800-pTZ-tgl與BSA混合溫育0，1，3，6 and 12h。

有鑒于此,我們進(jìn)而將tgl基因在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá),將含pET21b-tgl的陽性菌株BL21-pET21b-tgl在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6000.5左右,加IPTG誘導(dǎo),24h后收集菌體并破碎,測定酶活為0.45±0.06U/mL,表明TGase在大腸桿菌中表達(dá)后活性得到很大提高。周建[19]、劉凱[20]等人將枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)入大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)TGase后用Folk比色法法難以測得TGase活性,本實(shí)驗(yàn)通過比色法在WB800-pTZ-tgl發(fā)酵液中測到了較低的活性,而大腸桿菌表達(dá)后活性顯著增大,說明所構(gòu)建的重組菌株TGase得到高效表達(dá)。將樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳,結(jié)果表明,與對(duì)照相比,誘導(dǎo)后BL21-pET21b-tgl在28ku處有一明顯表達(dá)條帶(圖9),與TGase推測出的分子量相符,也與相關(guān)報(bào)道一致[21],證明tgl在BL21中得到了很好的表達(dá)。將樣品與BSA反應(yīng)不同時(shí)間后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,結(jié)果表明隨著反應(yīng)時(shí)間延長,BSA發(fā)生交聯(lián),分子量增大,不但在濃縮膠和分離膠之間形成明顯的大分子量蛋白質(zhì)交聯(lián)體,而且在點(diǎn)樣孔中也發(fā)現(xiàn)了明顯的蛋白沉積,且遠(yuǎn)多余WB800-pTZ-tgl發(fā)酵液與BSA反應(yīng)的樣品,表明tgl在大腸桿菌中較芽孢桿菌中表達(dá)效果更好,且活性明顯。與周建[19]等人用重組TGase蛋白催化BSA交聯(lián)的現(xiàn)像一致,并且本實(shí)驗(yàn)證明TGase在70℃下具有高活性,與相關(guān)文章表述的該酶具有的高溫活性相符[21-22]。

圖9 tgl基因在E. coli BL21中的表達(dá)Fig.9 Expression of tgl in E. coli BL21注：M：低分子量蛋白Marker；1：未經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)的 BL21-pET21b-tgl；2：經(jīng)TPTG誘導(dǎo)的BL21-pET21b-tgl。

3 結(jié)論與討論

通過凝膠法初篩及Folk比色法復(fù)篩,從土樣中分離得到的166株細(xì)菌中篩選到一株產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的芽孢桿菌,命名為TGase1318。通過16S rDNA序列比對(duì)、生理生化實(shí)驗(yàn)和形態(tài)學(xué)特征分析,鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌(B. subtilis)。

用PCR法克隆了該菌株的tgl基因,該基因長738bp,編碼的TGase由245個(gè)氨基酸組成,分子量為28.29ku,pI 6.71,與來自B.subtilis其他菌株的TGase相比有94%～100%的同源性。

構(gòu)建了重組質(zhì)粒pTZ-tgl和pET-21b-tgl,并分別在B.subtilisWB800和E.coliBL21中成功地表達(dá)了TGase,WB800-pTZ-tgl發(fā)酵液和BL21-pET21b-tgl菌液都能在70℃下催化BSA發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),大腸桿菌中活性達(dá)到0.45±0.06U/mL。

本研究對(duì)源于枯草芽孢桿菌的tgl基因成功地進(jìn)行了異源表達(dá),表達(dá)的TGase活性高于已有報(bào)道[19-20],并且在70℃下仍表現(xiàn)出明顯的對(duì)BSA的交聯(lián)作用,這一特性對(duì)高溫下的食品加工有潛在的利用價(jià)值。但tgl在枯草芽孢桿菌中表達(dá)量較低,還有待進(jìn)一步改善。

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Isolation and identification of a transglutaminase producing strain and itstglcloning and expression

ZHANG Ying-ying1,SHI Nan1,2,DU Ping-ping1,SHEN Pei-li1,LI Zhi-hui1,YU Hong-wei1,LU Hai-qiang1,SU Xu-dong1,ZHANG Wei1,TAN Jian-xin1,*

(1.College of Food Science and Technology,Engineering Research Center of Hebei Province for Agricultural Products Processing,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,China;2.College of Life Science,Hebei University,Baoding 071002,China)

By using the dilution plate method,166 bacterial strains isolated from soil samples and one strain,TGase1318,which could produce transglutaminase,was obtained after screening with gel formation method and Folk’s colorimetry method. The strain was identified asBacillussubtilisaccording to the morphology,physiological and biochemical characters as well as 16S rDNA sequence homological analysis. Thetglgene,which was a 738 bp long nucleotide,was cloned from the strain and encoded a 245 residue long TGase. Homological analysis of TGase peptide sequence revealed that it shared 94%～100% conservation with TGase of otherB.subtilisstrains released by NCBI. The expression recombinant plasmids pTZ-tgl and pET21b-tgl were constructed and transformed intoB.subtilisWB800 andE.coliBL21,respectively. The results of BSA crosslink at 70℃ indicated thetglgene was expressed in bothB.subtilisandE.coliwith TGase activity. This study laid a foundation for the application of TGase fromB.subtilisTGase1318 to food industry.

transglutaminase;Bacillussubtilis;cloning and expression;16S rDNA

2014-08-25

張瑩瑩(1989-),女,碩士研究生,研究方向:環(huán)境微生物學(xué)。

*通訊作者:檀建新(1968-),男,博士,教授,研究方向:微生物資源開發(fā)與利用。

多谷物主食冷凍面團(tuán)的關(guān)鍵技術(shù)研究(13227105D);植物多酚類功能性物質(zhì)對(duì)A(形成的影響(冀人社字[2010]195號(hào))。

TS201.3

A

1002-0306(2015)11-0141-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.020