雙酶酶解葵花籽粕蛋白制備抗氧化多肽的研究

董 聰,李 芳,王 琳,羅豐收,冷 娟,孔令明,*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052;2.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830021)

雙酶酶解葵花籽粕蛋白制備抗氧化多肽的研究

董 聰1,李 芳2,王 琳1,羅豐收1,冷 娟1,孔令明1,*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052;2.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830021)

葵花籽粕蛋白,酶解,多肽,抗氧化活性

向日葵,屬菊科向日葵屬,屬一年生草本植物,又名太陽花,對環(huán)境適應(yīng)性強、抗旱、抗?jié)?、抗堿[1],新疆地處歐亞大陸中部,光照資源豐富,干旱少雨,晝夜溫差大,較適合向日葵生長,目前全疆每年向日葵的種植面積在10萬畝左右,年產(chǎn)葵花籽25.39萬噸[2]。

葵花籽粕是葵花籽制油時的副產(chǎn)物,葵花籽粕營養(yǎng)物質(zhì)豐富,富含29%～43%的優(yōu)質(zhì)的植物蛋白[3],且氨基酸組成均衡,蛋白組成為:55%的球蛋白、1%～4%的醇溶蛋白、11%～17%的谷蛋白和20%的清蛋白[4]。據(jù)報導(dǎo),葵花籽粕中還含有大量的鈣、磷和煙酸[5],大量的類脂、碳水化合物、還原糖、灰分[6]及天然食用紅色素、糠醛等[7]。

葵花籽粕蛋白質(zhì)具有很好的蛋白特性,且可制備多肽抗氧化劑和ACE抑制劑[8],同時也是一種良好的肉類制品添加劑,但目前,葵花籽加工僅限于榨油和制作炒貨食品,其榨油后的粕含有豐富的蛋白質(zhì)但利用率不高,多用作牲畜飼料或者直接拋棄,其經(jīng)濟價值并未被充分利用,這不僅造成了極大的資源浪費而且還污染環(huán)境,對于其的精深加工值得人們重視。

表2 蛋白酶活力Table 2 Protease activity

為拓寬葵花籽粕綜合利用前景,對復(fù)合酶解葵花籽粕蛋白制備抗氧化活性多肽工藝進行優(yōu)化,從而提高葵花籽粕利用率。研究成果將為葵花籽綜合利用及開發(fā)功能性食品提供科學(xué)數(shù)據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葵花籽粕 新疆莊子實業(yè)有限公司提供;堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味酶及木瓜蛋白酶 南寧龐博生物工程有限公司;胰蛋白酶及胃蛋白酶 美國BIOSHARP公司;復(fù)合蛋白酶 上海源葉生物科技有限公司;無水乙醇、正己烷、氫氧化鈉、濃硫酸、鄰菲羅啉、硫酸亞鐵、鄰苯三酚等均為分析純。

SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器儀 上海青浦瀘西儀器廠;電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;雷磁PHS-3C 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;AL204-1C型電子天平 上海梅特勒托利多儀器有限公司;TD5A-WS臺式低速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;TU-1810紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葵花籽粕蛋白提取工藝 葵花籽粕→粉碎→脫脂→脫綠原酸→浸提(粕∶水=1∶25、pH10、超聲波溫度為50℃、超聲波功率700W、超聲時間90min)→離心(4500r/min、10min)→取上清→脫色(4%H2O2浸泡30min)→調(diào)pH為等電點→離心(4500r/min、15min)→取下層→真空冷凍干燥→粉碎(80目)→葵花籽粕蛋白粉[9]。

1.2.2 葵花籽粕蛋白中理化成分的測定 蛋白質(zhì)含量,凱氏定氮法(GB/T5009.5-2010);粗脂肪含量:索氏抽提法(GB/T14772-2008)。

1.2.3 蛋白酶活力的測定 參照文獻(xiàn)[10]方法(福林-酚法)。

1.2.4 水解度的測定 參照文獻(xiàn)[11]方法(pH-stat法)。水解度(DH)的計算公式為:

式中:V為消耗堿液體積(mL);c為堿液濃度(mol/L);ɑ為ɑ-氨基的解離度;m為底物中蛋白質(zhì)含量;htot為底物蛋白質(zhì)中的肽鍵總數(shù),對葵花籽粕蛋白而言,htot=7.5mmol/g。

1.2.5 抗氧化能力的測定

1.2.5.1 多肽羥基自由基(·OH)清除能力的測定 參照文獻(xiàn)[12]方法(鄰二氮菲-Fe2+氧化法)。

1.2.7 葵花籽粕蛋白制備葵花籽粕多肽的酶解工藝 葵花籽粕蛋白→粉碎(過80目篩)→懸浮液(2%(w/v))→熱變性處理(100℃,10min)→調(diào)pH至最適→水浴酶解→滅酶(100℃,15min)→離心(4500r/min,15min)→取上清液[13]即為葵花籽粕多肽酶解液。

1.2.8 單因素實驗 選用最適蛋白酶,確定在酶解過程中復(fù)合酶比例、pH、溫度、酶解時間、[E]/[S]、底物濃度對葵花籽粕多肽抗氧化能力的影響。

1.2.9 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解條件實驗 在單因素的基礎(chǔ)上,以抗氧化能力為響應(yīng)值,選擇酶解時間(X1)、pH(X2)及復(fù)合酶比例(X3)進行三因素三水平響應(yīng)面實驗,通過響應(yīng)曲面分析對酶解條件進行優(yōu)化,見表1。

表1 實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

2 結(jié)果與分析

2.1 葵花籽粕蛋白的蛋白質(zhì)含量

根據(jù)GB/T 5009.5-2010測得葵花籽粕蛋白中蛋白質(zhì)含量為74.20%。

2.2 葵花籽粕蛋白的粗脂肪含量

根據(jù)GB/T 14772-2008測得葵花籽粕蛋白中粗脂肪含量為8.76%。

2.3 蛋白酶活力的測定

蛋白酶活力的測定結(jié)果如表2所示。

根據(jù)酶活力大小及10000U/g的添加比例可計算出蛋白酶篩選中每種酶的添加質(zhì)量。

2.4 蛋白酶的篩選

選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶分別在各自最適酶解條件對葵花籽粕蛋白進行酶解,以羥自由基清除率、超氧陰離子清除率及水解度為指標(biāo),確定其抗氧化能力如表3所示。

表3 不同蛋白酶的抗氧化能力Table 3 Antioxidant capacity of the different protease

2. 5 單因素實驗結(jié)果

圖1 復(fù)合酶比例對抗氧化能力的影響Fig.1 Effect of different Composite enzyme ratio on the antioxidation of protein hydrolysates

圖2 [E]/[S]對抗氧化能力的影響Fig.2 Effect of different enzyme to substrate ratio on the antioxidation of protein hydrolysates

圖3 pH對抗氧化能力的影響Fig.3 Effect of different pH on the antioxidation of protein hydrolysates

圖4 底物濃度對抗氧化能力的影響Fig.4 Effect of different water to substrate ratio on the antioxidation of protein hydrolysates

表5 模型方差分析及模型系數(shù)顯著性檢驗·)Table 5 Model significant inspection and regression model analysis of ·)

圖5 溫度對抗氧化能力的影響Fig.5 Effect of different temperature on the antioxidation of protein hydrolysates

圖6 時間對抗氧化能力的影響Fig.6 Effect of different time on the antioxidation of protein hydrolysates

2.6 響應(yīng)面實驗設(shè)計模型及結(jié)果分析

對葵花籽粕多肽的·OH清除率響應(yīng)面模型進行方差分析,模型系數(shù)顯著性檢驗及資料結(jié)果見表6。

Y1(%)=66.64-0.11X1+2.04X2+7.24X3-2.82X1X2-0.048X1X+2.66X2X3-5.73X12-7.48X22-6.07X32

Y2(%)=49.86+3.60X1+2.500E-003X2+1.05X3-0.21X1X2+1.35X1X-1.44X2X3-3.70X12-3.48X22-4.61 X32

表6 模型方差分析及模型系數(shù)顯著性檢驗(·OH)Table 6 Model significant inspection and regression model analysis of variance(·OH)

表4 根據(jù)Design-erpert8.0設(shè)計響應(yīng)面實驗方案及結(jié)果Table 4 The test scheme and results according to Design-erpery8.0 design response surface

由表6回歸方差分析可知,模型的R2=0.9994說明回歸方程有意義,F模型=4708.30(p<0.0001),模型極顯著,失擬項F=0.33(p>0.05)結(jié)果不顯著,表6說明該模型與實際實驗擬合較好,可用于葵花籽粕蛋白質(zhì)酶解工藝實驗的預(yù)測。表6可知,時間和pH對·OH清除率影響極顯著,但在復(fù)合酶比例為堿性蛋白酶∶木瓜蛋白酶=1∶3～3∶1范圍內(nèi),復(fù)合酶比例對·OH清除率的影響作用不顯著;X1X2和X2X3差異極顯著說明時間與pH、pH與復(fù)合酶比例之間存在較強交互作用,X1X3差異高度顯著說明時間和復(fù)合酶比例之間存在交互作用;X12、X22、X32均較顯著說明各因素之間的關(guān)系是較為復(fù)雜的二次關(guān)系。圖7～圖11直觀地反映了個因素之間的交互作用及其對抗氧化性的影響。

圖7 時間和pH對·清除率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface of time and pH on the scavenging capacity of ·

圖8 pH和復(fù)合酶比例對·清除率影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface of pH and enzyme ratio on the scavenging capacity of ·

由圖9可知,復(fù)合酶添加比例一定時,隨著時間的延長和pH的增大,·OH清除率呈先升高后降低的趨勢。如圖所示,當(dāng)酶解時間一定時,pH達(dá)7.5前,·OH清除率隨pH的增大而增大;而pH達(dá)7.5后,繼續(xù)增大pH,·OH清除率反而降低;隨著酶解時間的延長,·OH清除率緩慢升高,酶解時間曲線變化較陡,酶解時間和pH比例之間的交互作用較為明顯。

圖9 時間和pH對·OH清除率影響的響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface of time and pH on the scavenging capacity of ·OH

由圖10可知,pH一定時,隨著時間的延長和復(fù)合酶比例的增大,·OH清除率呈先升高后降低的趨勢;當(dāng)復(fù)合酶比例為2∶1時,·OH清除率達(dá)最大值;·OH清除率隨時間的延長而緩慢增大,在3.4h左右達(dá)最大值,·OH清除率不再隨時間的延長而增大。等高線呈橢圓表明酶解時間和復(fù)合酶比例之間的交互作用顯著。

圖10 時間和復(fù)合酶比例對·OH清除率影響的響應(yīng)面圖Fig.10 Response surface of time and enzyme ratio on the scavenging capacity of ·OH

由圖11可知,酶解時間一定時,隨著復(fù)合酶比例和pH的增大,·OH清除率呈先升高后趨勢;但當(dāng)·OH清除率增大到極值后,并未隨復(fù)合酶比例和pH的增大而繼續(xù)升高,反之有降低的趨勢。等高線呈橢圓形說明時間和pH的交互作用顯著,與方差分析結(jié)果一致。

圖11 pH和復(fù)合酶比例對·OH清除率影響的響應(yīng)面圖Fig.11 Response surface of pH and enzyme ratio on the scavenging capacity of ·OH

3 結(jié)論

本文采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶對葵花籽粕蛋白質(zhì)進行復(fù)合酶解,得到抗氧化活性多肽。比較葵花籽粕多肽對羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率,確定其抗氧化作用。在單因素實驗的基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)曲面法獲得最優(yōu)酶解工藝為:酶解時間200min、pH7.6、復(fù)合酶比例2.5∶1、底物濃度2%、[E]/[S]2%、酶解溫度50℃,在此條件下,葵花籽粕多肽液對超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除率分別為68.06%和50.12%,且水解度為24.39%。

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Preparation enzymatic sunflower meal protein for the antioxidant activity polypeptide by Bienzyme

DONG Cong1,LI Fang2,WANG Lin1,LUO Feng-shou1,LENG Juan1,KONG Ling-ming1，*

(1.College of Food and pharmaceutics,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China;2.Xinjiang Institute of Light Industry Technology,Urumqi 830021,China)

sunflower meal protein;enzymatic hydrolysis;peptides;antioxidant activity

2014-07-28

董聰(1990-),女,碩士,研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加工及綜合利用。

*通訊作者:孔令明(1976-)，男，博士，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項目(2013911070)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)11-0116-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.015