正交試驗優(yōu)選雪上一枝蒿中烏頭堿的提取工藝

曹紅云，牛延菲，秦 波，劉開慶，游 燕

(云南省藥物研究所，云南 昆明 650111)

正交試驗優(yōu)選雪上一枝蒿中烏頭堿的提取工藝

曹紅云，牛延菲，秦 波，劉開慶，游 燕△

(云南省藥物研究所，云南 昆明 650111)

目的 優(yōu)化雪上一枝蒿中烏頭堿的提取工藝。方法 采用正交設(shè)計法考察料液比、乙醇濃度、提取時間3個因素對雪上一枝蒿中烏頭堿提取率的影響，以HPLC法測定提取液中烏頭堿的含量。結(jié)果 乙醇用量對試驗結(jié)果有顯著影響，其他因素影響不顯著，最佳提取條件為3倍量70%乙醇滲漉提取8 d。結(jié)論 該方法穩(wěn)定可靠，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

雪上一枝蒿；烏頭堿；提??；正交試驗

1 儀器與試藥

1.1 儀器及試劑 美國Agilent1100高效液相色譜儀(四元泵、DAD檢測器、自動進(jìn)樣器、在線真空脫氣機(jī)、智能化柱溫箱及Agilent化學(xué)工作站)；N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；TC-6 KA型電子天平；DFY-500型粉碎機(jī)；SK-3200LH型超聲清洗儀(180W，59kHz)；乙腈、四氫呋喃(色譜純，默克公司)；其余為分析純；水為云南省藥物研究所自制超純水。

1.2 試藥 雪上一枝蒿藥材購自昆明菊花園中藥材市場，其產(chǎn)地為昭通，經(jīng)云南省藥物所究所天然藥物資源研究中心正高級工程師高麗鑒定為短柄烏頭AconitumbrachypodumDiels的干燥塊根。烏頭堿對照品(中國食品藥品生物檢定所，純度為98.8%)。

2 方法與結(jié)果[5-7]

2.1 色譜條件 色譜柱 Shiseido MGⅡC18，4.6×250 mm，5 μm(日本 資生堂)；以乙腈：四氫呋喃(25：15)為流動相A，以0.1 mol/L醋酸銨溶液(每1000 mL加冰醋酸0.5 mL)為流動相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為235 nm。理論板數(shù)按烏頭堿峰計算應(yīng)不低于3000。烏頭堿對照品HPLC圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序

A—空白對照;B—烏頭堿對照;C—樣品;D—樣品+烏頭堿對照

圖1 烏頭堿對照品HPLC圖

2.2 對照品溶液的制備 取烏頭堿對照品適量，精密稱定，加二氯甲烷制成每1 mL含烏頭堿0.2 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 精密量取提取液10 mL，置圓底燒瓶中，50℃減壓濃縮，加氨試液3 mL，精密加入異丙醇-乙酸乙酯(1：1)混合溶液50 mL，稱定重量，超聲處理(功率300W，頻率40kHz；水溫在25℃以下)30 min，放冷，再稱定重量，用異丙醇-乙酸乙酯(1：1)混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10 mL，40℃以下減壓回收溶劑至干，殘渣精密加二氯甲烷溶解定容于5ml容量瓶中，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系的考察 分別精密稱取烏頭堿對照品

圖2 烏頭堿線性關(guān)系圖

10.05 mg，置50 mL容量瓶中，加二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，制得烏頭堿濃度為0.1986 mg/mL的對照品儲備溶液，精密吸取以上儲備液，按“2.1”項色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量分別為1、2、5、10、15、20、30 μL，記錄峰面積。以含量(X)對峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，得烏頭堿回歸方程：Y=1383.4X-25.738，相關(guān)系數(shù)r=0.9998。結(jié)果表明，在上述色譜條件下，烏頭堿在0.1986μg-5.9580μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗 精密吸取烏頭堿濃度為0.1986 mg/ml的對照品溶液，按“2.1”項色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量10μl，連續(xù)進(jìn)樣6針，以峰面積計算，算得RSD=1.8%(n=6)，結(jié)果表明本法具有良好的儀器精密度。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取已制備好的供試品溶液按“2.1”項色譜條件，分別于0、6、8、12、24 h進(jìn)樣，進(jìn)樣體積10 μL，以峰面積計算，結(jié)果RSD=1.9%(n=5)，所得的樣品中烏頭堿含量基本一致，說明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

根據(jù)PT中所得到的位置和距離信息，按照第1.3節(jié)中的方法，得到每個區(qū)域內(nèi)點，以每個區(qū)域內(nèi)點到原點(目標(biāo)船)距離為指標(biāo)，將距離分為若干區(qū)間，分別統(tǒng)計各個區(qū)間內(nèi)出現(xiàn)的頻次和頻率。將每個區(qū)間中點值作為該區(qū)間的值，以頻率近似替代樣本概率。假設(shè)目標(biāo)船到周圍最近船舶的距離分布是連續(xù)的，利用MATLAB曲線擬合工具箱CFtool對區(qū)間上系列點及其概率進(jìn)行擬合，即可得到每個區(qū)域內(nèi)目標(biāo)船到周圍船舶的距離的概率密度分布函數(shù)f(D)。

2.7 重復(fù)性試驗 精密量取同一批次的樣品6份，按“2.3”項下供試品溶液制備方法制備，按“2.1”項色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，測定烏頭堿含量。計算得RSD=1.7%(n=6)，結(jié)果表明本法具有良好的重復(fù)性。

2.8 加樣回收率 精密量取6份已知烏頭堿含量的供試品，每份5 mL，分別加上述混合對照品溶液0.5 mL，然后按“2.3”項下供試品溶液制備方法同法處理，將處理好的供試品溶液按“2.1”項色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，測定。計算回收率，結(jié)果表明，該分析方法的烏頭堿回收率為96.37%～102.00%，RSD值為2.3%(n=6)。試驗結(jié)果表明，回收率良好。

3 正交試驗

3.1 試驗設(shè)計 以A：乙醇用量(藥材量倍數(shù))、B：乙醇濃度、C：提取時間作為考察因素，用L9(34)正交試驗方案，試驗設(shè)計見表2。

表2 因素水平表

3.2 提取液制備 將雪上一枝蒿藥材粉碎為粗顆粒，稱取200 g，投入滲漉罐中，按正交設(shè)計方案，用乙醇溶劑均勻潤濕，密閉放置1 d后，開始滲漉提取，制備得提取液。

3.3 烏頭堿含量測定 按“2.1～2.3”項下的HPLC法對提取液進(jìn)行烏頭堿含量測定，結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 L9(34)正交試驗直觀分析結(jié)果

表4 L9(34)正交試驗方差分析結(jié)果

注：F0.05(2，2)……19

實驗結(jié)果直觀分析表明：影響烏頭堿提取的因素大小依次是A>C>B。方差分析結(jié)果表明，乙醇用量對烏頭堿的提取有顯著性影響(P<0.05)，提取時間、乙醇濃度的影響不大。從實驗結(jié)果可得出最佳提取工藝為A3B2C3，即優(yōu)選工藝為每天3倍量70%乙醇滲漉提取8天。

4 工藝驗證試驗

取5批雪上一枝蒿藥材各200 g，按照正交設(shè)計優(yōu)選工藝，即用3倍量70%乙醇滲漉提取8 d，提取液按“2.1～2.3”項下處理，測定烏頭堿含量，其提取率分別為63.8%、67.6%、65.8%、63.9%、64.5%。

5 討論

雪上一枝蒿為毒性藥材，其烏頭堿的口服中毒量一般為0.2mg，致死量為3～5mg[8]，在制劑入藥時要慎重其用量。如在處方用量一定的情況下，可考慮將藥材進(jìn)行水泡、水煮、甘草制、油制、童尿制、醋制等炮制方法使其毒性降低[9]。雪上一枝蒿制劑多為外用，主要有消腫止痛的功效?，F(xiàn)代研究表明，雪上一枝蒿中所含烏頭堿具有顯著的抗炎、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、局麻等活性[10-12]，其鎮(zhèn)痛機(jī)理主要是烏頭堿抑制神經(jīng)干中神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)或使神經(jīng)干完全喪失興奮和傳導(dǎo)的能力[12]。如經(jīng)炮制，其毒性降低的同時藥效也會大大降低，所以這就要求對制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，將烏頭堿量控制在一個安全有效的范圍內(nèi)。

試驗中參考了2010年版《中國藥典》一部草烏含量測定項下的檢測方法進(jìn)行了摸索試驗，確定了高效液相色譜法測定雪上一枝蒿提取液中烏頭堿的方法，方法學(xué)驗證試驗表明，該方法準(zhǔn)確可行，重復(fù)性好，可用于雪上一枝蒿提取液中烏頭堿檢測。由于雪上一枝蒿中次烏頭堿和新烏頭堿含量較低，所以試驗中僅選擇烏頭堿為提取工藝評價指標(biāo)。

由試驗結(jié)果可知，影響烏頭堿提取的主次因素為：A>C>B，最佳提取工藝為A3B2C3，即3倍量70%乙醇滲漉提取8 d。根據(jù)篩選得到的最佳工藝提取5批樣品，平均提取率為65%，RSD=2.46%(n=5)，進(jìn)一步驗證該工藝穩(wěn)定可行，具有較好的重復(fù)性。

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曹紅云(1983-)，女，碩士，工程師，主要從事中藥分析。E-mail：caohy612@163.com。

△通信作者：游燕，E-mail：youwanyan@sohu.com

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