HPLC法同時(shí)測(cè)定羚羊感冒口服液中牛蒡苷和連翹苷的含量

汪玉萍，郝自新

(安慶市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽 安慶 246001)

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HPLC法同時(shí)測(cè)定羚羊感冒口服液中牛蒡苷和連翹苷的含量

汪玉萍，郝自新*

(安慶市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽 安慶 246001)

目的： 建立HPLC法同時(shí)測(cè)定羚羊感冒口服液中牛蒡苷和連翹苷的含量。方法：采用安捷倫 C18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱，流動(dòng)相：乙腈-水(25：75)，流速：1.0mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm，柱溫：30℃。結(jié)果：牛蒡苷在0.71～4.26μg之間線性關(guān)系良好，r=0.9996，連翹苷在0.0838～0.5028μg之間線性關(guān)系良好，r=0.9995，牛蒡苷的平均回收率為98.50%,RSD=1.06%，連翹苷的平均回收率為98.14%，RSD=0.83%。結(jié)論：試驗(yàn)表明，該方法操作簡(jiǎn)單，分離效果好，靈敏度高，可以用于羚羊感冒口服液的質(zhì)量控制。

羚羊感冒口服液；牛蒡苷；連翹苷；高效液相色譜

羚羊感冒口服液是由羚羊角、牛蒡子、金銀花、連翹等十味藥制成的復(fù)方制劑，具有清熱解表的功效。用于傷風(fēng)咳嗽，流行性感冒，頭暈發(fā)熱，咽喉腫痛[1]。該制劑中牛蒡子具有疏散風(fēng)熱，宣肺透疹，解毒利咽的功效；連翹具有清熱解毒，消腫散結(jié)，疏散風(fēng)熱的功效。連翹苷和牛蒡苷分別為連翹和牛蒡子的特征性有效成分[2-3]，因此連翹苷和牛蒡苷可作為羚羊感冒口服液的標(biāo)志性成分之一；現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中采用薄層色譜掃描法僅測(cè)定牛蒡苷的含量[1]，但薄層色譜掃描法操作繁瑣，影響因素多，專屬性較差，誤差大。為了更好的、更全面的控制藥品內(nèi)在質(zhì)量，保證臨床療效。本文建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定羚羊感冒口服液中連翹苷和牛蒡苷含量的方法，為制定更加嚴(yán)格的羚羊感冒口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

安捷倫 1260高效液相色譜儀(G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器、G1314A型四元梯度泵、G1314B紫外檢測(cè)器、Agilent色譜工作站，美國(guó)Agilent公司)；METTER-AE240 電子天平(瑞士梅特勒公司)；HT-350A型超聲波中藥處理機(jī)(山東濟(jì)寧亨通電子設(shè)備廠)；牛蒡苷對(duì)照品(批號(hào)：110819-201108，供含量測(cè)定用，純度：94.6%)；連翹苷對(duì)照品(批號(hào)：110821-201213，供含量測(cè)定用，純度：95.3%)；均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；羚羊感冒口服液(批號(hào)130516，130726，131116，樣品都為市場(chǎng)抽檢樣品)；乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其它試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫 C18柱(250mm×4.6mm,5μm)，柱溫：30℃；流動(dòng)相：水-乙腈(75:25)，流速：1.0mL/min,進(jìn)樣量：10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm。牛蒡苷峰和連翹苷峰的分離度大于1.5，理論板數(shù)按牛蒡苷和連翹苷峰計(jì)算均不低于8000。

1.2.2 溶液的制備

混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取牛蒡苷對(duì)照品和連翹苷對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.3550、0.0419mg/mL的混合對(duì)照品溶液，作為混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備 取本品，混勻，精密量取10mL，置25mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理10min，放至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液即得。

陰性對(duì)照溶液的制備 按處方組成分別制備不含連翹和不含牛蒡子的羚羊感冒口服液陰性樣品，并按供試品溶液制備方法分別制備缺連翹陰性對(duì)照溶液和缺牛蒡子陰性對(duì)照溶液。

1.2.3 方法學(xué)考察與樣品測(cè)定

按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，分別對(duì)分析方法的線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性等項(xiàng)目按照分析方法要求進(jìn)行考察，然后分別取3批羚羊感冒口服液樣品適量，測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察

精密量取連翹苷和牛蒡苷的混合對(duì)照品溶液2，4，6，8，10，12μL，注入液相色譜儀，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程。得牛蒡苷回歸方程：Y=5.3189×102X+38.69,r=0.9996,結(jié)果表明，牛蒡苷進(jìn)樣量在0.71～4.26μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；得連翹苷回歸方程：Y=6.1388×102X+5.47,r=0.9995,結(jié)果表明，連翹苷進(jìn)樣量在0.0838～0.5028μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2 精密度考察

吸取混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μL，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，測(cè)得牛蒡苷峰面積，RSD為0.56%；測(cè)得連翹苷峰面積，RSD為0.78%，表明儀器精密度良好。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取同一批號(hào)樣品(130516)6份按“1.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件分析測(cè)定。結(jié)果牛蒡苷平均含量為0.6762mg/mL, RSD為0.79%；連翹苷平均含量為0.0726mg/mL, RSD為1.1%。表明本品測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取“1.2.2”項(xiàng)下的供試品溶液分別在配制后0，2，4，6，8，12h，進(jìn)樣10μL，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件分析測(cè)定。記錄牛蒡苷峰面積和連翹苷峰面積，RSD分別為0.37%和0.89%，表明樣品溶液在12h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5 專屬性試驗(yàn)

精密量取“1.2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液、樣品溶液、陰性對(duì)照溶液各10μL，注入液相色譜儀，色譜圖見(jiàn)圖1，結(jié)果表明，供試品溶液中連翹苷和牛蒡苷保留時(shí)間與對(duì)照品溶液中連翹苷和牛蒡苷保留時(shí)間一致：且兩成分均得到很好的分離；同時(shí)在連翹苷和牛蒡苷色譜峰附近陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量的同一批(批號(hào)：130516，牛蒡苷含量為0.6762mg/mL；連翹苷含量為0.0726mg/mL)的樣品6份，每份5mL,加水補(bǔ)足至10mL，分別精密加入牛蒡苷和連翹苷混合對(duì)照品溶液(牛蒡苷濃度0.3550mg/mL；連翹苷濃度0.0419mg/mL，配制溶劑為甲醇)10mL，按上述供試品溶液的制備方法制備及上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.7 樣品的含量測(cè)定

樣品含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，牛蒡苷含量測(cè)定結(jié)果為0.6762～0.7265 mg/mL，連翹苷的含量測(cè)定結(jié)果為0.0726～0.0892 mg/mL，檢測(cè)結(jié)果比較低。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果(mg/mL)

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

經(jīng)紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定，牛蒡苷對(duì)照品在228nm,278nm處有最大吸收，連翹苷對(duì)照品在208、228、277nm處有最大吸收，再參考中國(guó)藥典2010年版一部中羚羊感冒片中牛蒡苷含量測(cè)定波長(zhǎng)和中國(guó)藥典2010年版一部中連翹項(xiàng)下的連翹苷含量測(cè)定波長(zhǎng)[4]，經(jīng)試驗(yàn)牛蒡苷和連翹苷在280nm波長(zhǎng)處都有較大吸收峰，且峰型好，無(wú)干擾，能同時(shí)測(cè)定牛蒡苷和連翹苷的含量；最后確定該試驗(yàn)的測(cè)定波長(zhǎng)為280nm。

3.2 流動(dòng)相的確定

在參考其它文獻(xiàn)和中國(guó)藥典2010年版一部中羚羊感冒片中牛蒡苷含量測(cè)定的流動(dòng)相以及中國(guó)藥典2010年版一部中連翹項(xiàng)下的連翹苷含量測(cè)定的流動(dòng)相[4]，分別考察了不同流動(dòng)相(乙腈-水系統(tǒng)、乙腈-0.2%磷酸系統(tǒng)、甲醇-0.4%磷酸系統(tǒng))等，牛蒡苷和連翹苷的分離情況，經(jīng)試驗(yàn)采用乙腈-水(25∶75)為流動(dòng)相時(shí)，樣品中牛蒡苷和連翹苷分離效果好，出峰時(shí)間適中，分離度達(dá)到要求，無(wú)雜質(zhì)干擾，最后采用乙腈-水(25∶75)為流動(dòng)相。

3.3 羚羊感冒口服液中連翹苷含量較低

高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果顯示，三批羚羊感冒口服液中連翹苷含量差異不大，但含量較低，故有必要增加連翹苷的含量測(cè)定并規(guī)定合理的最低限度，監(jiān)督藥品生產(chǎn)企業(yè)嚴(yán)格按照批準(zhǔn)的生產(chǎn)工藝進(jìn)行生產(chǎn)，以確保藥品內(nèi)在質(zhì)量，保證藥品的臨床療效。

4 結(jié)論

關(guān)于牛蒡苷和連翹苷的含量測(cè)定方法已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道[5-13],本文建立的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，為提高和完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更加科學(xué)有效地控制其內(nèi)在質(zhì)量提供了方法和依據(jù)。

[1]衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn).新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)中藥第三十八冊(cè) [S].

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(一部)[S].

[3]王潞，趙烽，劉珂．牛蒡子苷及牛蒡子苷元的藥理作用研究進(jìn)展 [J].中草藥，2008，39(3)：467-470.

[4]李雙，王東強(qiáng)，李志軍．連翹主要有效成分的提取與藥理作用 [J].黑龍江中醫(yī)藥，2011，39(1)：67-70.

[5]權(quán)勤波，李啟紅. HPLC測(cè)定銀翹解毒丸中綠原酸和牛蒡苷的含量 [J].中國(guó)藥師，2013，16(10)：1510-1512.

[6]郭淑英，郝乘儀，馮波.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定銀翹解毒丸中連翹苷的含量[J].中國(guó)藥房，2009，20(24)：1896-1897.

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Determination of Arctiin and Forsythin Contained in Lingyang Ganmao Oral Liquid by HPLC

WANG Yu-ping,HAO Zi-xin*

(Anqing Testing Center for Food and Drug, Anqing 246001，China)

Objective: To establish an HPLC method for determination of arctiin and phillyrin in Lingyang Ganmao oral liquid. Methods：The Agilent C18 (4.6mm×250mm,5μm)column was used ,the mobile phase was acetonitrile-water(25:75),the flow rate was 1.0ml·min-1,the detection wavelength was 280nm,and the coulumn temperature was 30℃.Results： The calibration curves of arctiin and phillyrin were linear respectively at the range of 0.71～4.26μg(r=0.9996),0.0838～0.5028μg(r=0.9995).The average recoveries were 98.50% for arctiin (RSD=1.06%) and 98.14% for phillyrin (RSD=0.83%).Conclusion：The method is simple and sensitive with good separation efficiency.It can be used for routine quality control of Lingyang Ganmao oral liquid.

Lingyang Ganmao Oral Liquid; Arctiin; Forsythin; HPLC

2015-05-05

安徽省藥品評(píng)價(jià)監(jiān)督抽檢計(jì)劃項(xiàng)目。

汪玉萍(1977-)，女，安徽省安慶市人，學(xué)士，主管中藥師，主要從事藥品質(zhì)量分析研究。*通訊作者：郝自新，副主任中藥師，E-mail:aghzx@sina.com。

R917

A

1673-8772(2015)04-0038-04