HPLC梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定丹芎跌打膏中4種主要成分的含量

馬靈珍

(亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 亳州 236800)

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HPLC梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定丹芎跌打膏中4種主要成分的含量

馬靈珍

(亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 亳州 236800)

目的:建立了同時(shí)測(cè)定丹芎跌打膏中4個(gè)主要成分(京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、去甲氧基姜黃素和姜黃素)含量的高效液相色譜檢測(cè)方法。方法：采用依利特C18柱，流動(dòng)相為乙腈(A)和0.4%冰醋酸溶液(B)，梯度洗脫，流速為1.2 mL/min；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)λ1=238 nm(京尼平龍膽雙糖苷和梔子苷)，λ2=430 nm(去甲氧基姜黃素和姜黃素)。結(jié)果：在優(yōu)化的色譜條件下，京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、去甲氧基姜黃素和姜黃素的線(xiàn)性范圍分別為4.10～82.00 μg/mL(r=0.999 3)、5.69～113.80 μg/mL(r=0.999 9)、7.80～156.00 μg/mL(r=0.999 5)和8.06～161.20 μg/mL(r=0.999 8)；4種成分的平均加樣回收率(n=6)分別為97.89%、99.24%、97.16%、96.89%，RSD分別為1.16%、0.97%、1.56%、1.23%。結(jié)論：該方法為丹芎跌打膏的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

丹芎跌打膏；京尼平龍膽雙糖苷；梔子苷；去甲氧基姜黃素；姜黃素

丹芎跌打膏為治療軟組織損傷類(lèi)的復(fù)方制劑，現(xiàn)收載于國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編骨傷科分冊(cè)[1]，由梔子、姜黃等十三味藥材和植物油、硬脂酸、甘油、三乙醇胺、凡士林、羊毛脂、蒸餾水等加工而成，該制劑具有活血散瘀、消腫止痛的功效，是治療各種急性、亞急性軟組織損傷等病癥的首選藥物。原丹芎跌打膏標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)處方中單一成分進(jìn)行了研究，通過(guò)對(duì)維普、萬(wàn)方及知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，未檢索到對(duì)該制劑中任何藥味進(jìn)行定量檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道，而該制劑為十三味中藥材加工而成，單一的含量檢測(cè)不能有效地控制復(fù)方制劑的含量。梔子和姜黃為丹芎跌打膏中的主要藥物，梔子[2]外用具有消腫止痛的功效，對(duì)外治扭挫傷痛效果顯著；姜黃具有破血行氣，通經(jīng)止痛的功效，對(duì)風(fēng)濕肩臂疼痛、跌撲腫痛等效果顯著。本研究對(duì)該制劑中藥材梔子、姜黃中的4個(gè)成分京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、去甲氧基姜黃素和姜黃素進(jìn)行定量測(cè)定方法學(xué)研究，對(duì)丹芎跌打膏的全面質(zhì)量控制具有重要意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 儀器與試藥

安捷倫1200型HPLC色譜儀；VS-100UE型恒溫超聲波提取機(jī)(無(wú)錫沃信儀器有限公司)；XS205DU型十萬(wàn)分之一電子天平(梅特勒-托利多)。

梔子苷對(duì)照品(110749-201316，含量以97.5%計(jì)，常溫遮光保存)、姜黃素(110823-201405，含量以98.9%計(jì)，冷凍保存)由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；京尼平龍膽雙糖苷對(duì)照品(29307-60-6，含量以98.0%計(jì)，2-8℃干燥遮光密封保存)、去甲氧基姜黃素(24939-17-1，含量以98.0%計(jì)，干燥、避光、密封保存)由四川省維克奇生物科技有限公司提供；丹芎跌打膏(每支裝10g；批號(hào)為20150206、20150213、20150408)購(gòu)于長(zhǎng)春普華制藥股份有限公司；乙腈為色譜純，甲醇、冰醋酸為分析純，水為重蒸餾水。

2 試驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

采用依利特C18色譜柱(200 mm×4.6 mm，5um)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.4%冰醋酸溶液(B)，按表1進(jìn)行梯度洗脫[3-10]；檢測(cè)波長(zhǎng)(0～28min，λ1=238 nm[11-13]，28～50 min，λ2=430 nm[14])；流速采用1.2 mL/min；柱溫采用30℃；進(jìn)樣量為20 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 對(duì)照品溶液的配制方法

2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 分別稱(chēng)取對(duì)照品京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、去甲氧基姜黃素和姜黃素適量，分別加甲醇溶解并用甲醇稀釋?zhuān)瞥删┠崞烬埬戨p糖苷、梔子苷、去甲氧基姜黃素和姜黃素質(zhì)量濃度分別為0.410 mg/mL、0.569 mg/mL、0.780 mg/mL、0.806 mg/mL單一成分的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 分別吸取2.2.1項(xiàng)下已配制的對(duì)照品儲(chǔ)備液1.5、5.0、1.5、2.5 mL，用甲醇稀釋?zhuān)瞥擅? mL分別含京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、去甲氧基姜黃素、姜黃素為12.3、56.9、23.4、40.3 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.3 樣品溶液的制備方法

2.3.1 樣品溶液的制備 取丹芎跌打膏4.0 g，精密稱(chēng)定，置于50mL具塞錐形瓶中，再精密加入甲醇50mL，稱(chēng)定其總重量，記錄稱(chēng)量的數(shù)據(jù)，采用加熱回流法對(duì)樣品進(jìn)行處理40 min，取出后自然放至室溫，再次稱(chēng)定總重量，記錄具體數(shù)據(jù)，用甲醇補(bǔ)足重量，振搖均勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為樣品溶液。

2.3.2 陰性對(duì)照溶液的制備 按照國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編骨傷科分冊(cè)丹芎跌打膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的處方工藝，分別制備不含梔子、姜黃的樣品，按照文中2.3.1項(xiàng)下樣品溶液的制備方法分別制備成梔子、姜黃空白溶液。

本實(shí)驗(yàn)選用玉米-豆粕型肉鴨飼糧，肉鴨基礎(chǔ)飼糧配制參照中華人民共和國(guó)肉鴨營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（2012）和NRC（1994）標(biāo)準(zhǔn)，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別精密吸取樣品溶液、混合對(duì)照品溶液、梔子空白溶液和姜黃空白溶液，參照上述色譜條件各進(jìn)樣20 μL進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰。結(jié)果在該色譜條件下，按保留時(shí)間先后的出峰順序?yàn)椋壕┠崞烬埬戨p糖苷、梔子苷、去甲氧基姜黃素、姜黃素，樣品溶液和混合對(duì)照品溶液所測(cè)各組分保留時(shí)間一致；空白樣品在對(duì)照品相應(yīng)位置處無(wú)吸收峰。結(jié)果表明處方中其他藥物對(duì)所測(cè)成份的測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1～4。

3.2 線(xiàn)性關(guān)系考察

分別精密吸取上述制備的對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mL，將其分別置于10 mL的容量瓶中并用甲醇稀釋成系列濃度的混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣20 μL進(jìn)行測(cè)定，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并進(jìn)行回歸計(jì)算，實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 線(xiàn)性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3.3 方法的精密度

精密吸取2.2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液20μL，參照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、去甲氧基姜黃素和姜黃素的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，京尼平龍膽雙糖苷為1.53%、梔子苷為0.74%、去甲氧基姜黃素為1.09%、姜黃素為1.31%。

3.4 方法的重復(fù)性

3.5 溶液的穩(wěn)定性

取同一批次丹芎跌打膏樣品(批號(hào)為20150408)的同一樣品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、去甲氧基姜黃素和姜黃素的RSD，京尼平龍膽雙糖苷為1.56%、梔子苷為0.71%、去甲氧基姜黃素為1.33%、姜黃素為0.57%，表明24h內(nèi)樣品溶液具有良好的穩(wěn)定性。

3.6 方法的加樣回收率

取6份已知含量的丹芎跌打膏(批號(hào)為：20150408；京尼平龍膽雙糖苷為0.142 mg/g、梔子苷為0.729 mg/g、去甲氧基姜黃素為0.304 mg/g、姜黃素為0.487 mg/g)適量，取丹芎跌打膏2.0 g，精密稱(chēng)定，置50mL具塞錐形瓶中，精密加入混合對(duì)照品溶液25 mL、甲醇25 mL，并稱(chēng)定總重量，記錄具體數(shù)據(jù)，采用加熱回流法對(duì)樣品進(jìn)行處理40 min，取出后自然放至室溫，再次稱(chēng)定總重量，記錄具體數(shù)據(jù)，用甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，過(guò)濾，作為加樣樣品試液。參照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，計(jì)算各組分回收率，結(jié)果上述4個(gè)成份的平均加樣回收率(n=6)分別為97.89%、99.24%、97.16%、96.89%，RSD分別為1.16%、0.97%、1.56%、1.23%。

3.7 樣品測(cè)定

取3個(gè)不同批號(hào)的丹芎跌打膏樣品，參照2.3.1項(xiàng)下制備樣品溶液的處理方法，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、去甲氧基姜黃素和姜黃素含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3，mg/g)

4 討論

4.1 樣品提取條件的優(yōu)化

樣品溶液制備過(guò)程中首先選取加熱回流60 min和超聲提取60 min分別進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)峰面積對(duì)比，結(jié)果顯示加熱回流60 min的提取率明顯高于超聲提取60 min；在此實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)加熱回流時(shí)間(20min、40min和60min)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示加熱回流40 min和60 min峰面積相差不大，但明顯大于加熱回流20min時(shí)的峰面積。故選取加熱回流40 min作為樣品溶液制備的最佳提取條件。

4.2 流動(dòng)相的選擇

分別采取乙腈-水、乙腈-0.5%磷酸溶液、乙腈-0.4%冰醋酸溶液、乙腈-0.3%甲酸溶液不同比例梯度洗脫，結(jié)果表明，在乙腈-0.4%冰醋酸溶液為流動(dòng)相按照文中比例洗脫時(shí)，各色譜峰的發(fā)布、峰形和分離度效果最佳，故選取乙腈-0.4%冰醋酸溶液為該制劑4個(gè)主要成分含量測(cè)定的流動(dòng)相。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編骨傷科分冊(cè)[S].

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Simultaneous Determination of Four Main Ingredients in Danxiong Dieda Gao by HPLC

MA Ling-zhen

(School of Pharmacy,Bozhou Vocational and Technical College, Bozhou,236800，China)

Objective:To establish a HPLC method for the simultaneous determination of four main components(Genipin-1-β-D-gentiobioside,geniposide,demethoxycurcumin and curcumin) in Danxiong Dieda Gao. Method:The HPLC separation was performed on a Hypersil C18 column eluted with the mobile phases of acetonitrile(A) - 0.4% acetic acid solution(B) in a gradient elution and the flow rate was 1.2 mL·min-1.The column temperature was at 30 ℃.Genipin-1-β-D-gentiobioside and geniposide were detected at 238 nm,demethoxycurcumin and curcumin were detected at 430 nm.Results:The chromatographic peaks of four main components and the corresponding spectra were ideal under the optimal conditions.Genipin-1-β-D-gentiobioside,geniposide,demethoxycurcumin and curcumin had good linearity at 4.10～82.00 μg/mL(r=0.999 3),5.69～113.80 μg/mL(r=0.999 9),7.80～156.00 μg/mL(r=0.999 5),8.06～161.20 μg/mL(r=0.999 8),respectively.The average recoveries and RSD were 97.89%(1.16%),99.24%(0.97%), 97.16%(1.56%) and 96.89%(1.23%),respectively.Conclusion:The method can provide reference for evaluating the quality of Danxiong Dieda Gao.

Danxiong Dieda Gao;Genipin-1-β-D-gentiobioside;Geniposide; Demethoxycurcumin;Curcumin

2015-05-13

安徽省高等學(xué)校教學(xué)質(zhì)量與教學(xué)改革工程實(shí)訓(xùn)中心建設(shè)項(xiàng)目(20101460)。

馬靈珍(1982-)，男，安徽省亳州市人，碩士，講師，主要從事中藥生產(chǎn)與質(zhì)量控制研究。

R284.1

A

1673-8772(2015)04-0033-05