皖北地區(qū)優(yōu)良大豆根瘤菌的篩選

吳 萍，何慶元，李正鵬，史 鈞，祝嫦巍

(安徽科技學(xué)院 應(yīng)用微生物研究所， 安徽 鳳陽(yáng) 233100)

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皖北地區(qū)優(yōu)良大豆根瘤菌的篩選

吳 萍，何慶元，李正鵬，史 鈞，祝嫦巍

(安徽科技學(xué)院 應(yīng)用微生物研究所， 安徽 鳳陽(yáng) 233100)

利用采集于皖北不同地區(qū)分離獲得的14株大豆根瘤菌與大豆品種“南農(nóng)1138-2”進(jìn)行匹配試驗(yàn)。結(jié)果表明，根瘤菌菌株AHM2B、ABL9-2 、AWL26和AFL15與 “南農(nóng)1138-2”有較好的共生性，其中菌株AHM2B、ABL9-2對(duì)總根瘤數(shù)、根瘤干重、植株干重、株高的影響較大，菌株AWL26和AFL15對(duì)提高葉綠素含量和全氮量影響顯著。綜合試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為以AHM2B和ABL9-2較其他菌株表現(xiàn)更為突出。

大豆;根瘤菌;篩選;共生固氮

根瘤菌是一種分布在土壤中的革蘭氏陰性細(xì)菌[1]。它侵入大豆根部后形成根瘤，與大豆植株構(gòu)成了共生固氮體系，大豆為根瘤菌的生長(zhǎng)提供所需營(yíng)養(yǎng)和微環(huán)境，根瘤菌通過(guò)固定空氣中氮為大豆生長(zhǎng)提供氮源[2-3]。豆科植物與根瘤菌構(gòu)成的固氮體系是生物固氮重要的組成部分，其體系所固定的氮約占生物固氮總量的的65%[4-7]。目前生物固氮在很多國(guó)家應(yīng)用，其中美國(guó)、阿根廷和巴西等國(guó)應(yīng)用的最為廣泛，獲得了巨大的利益[8]。巴西是最早進(jìn)行大豆根瘤菌篩選計(jì)劃的國(guó)家，也是受益最大的國(guó)家[10]。但是，在我國(guó)由于地域和品種的差異導(dǎo)致了大豆植株與根瘤菌的匹配性不高，結(jié)瘤率和固氮能力很弱，根瘤菌菌劑的使用效果很不理想[11]。所以能夠篩選出適合不同地域使用的根瘤菌的意義重大。黃淮海地區(qū)是我國(guó)大豆的主產(chǎn)區(qū)之一，產(chǎn)量占全國(guó)的30%以上[12]。皖北地區(qū)大豆的種植面積和產(chǎn)量在黃淮海地區(qū)都占很大比重，篩選出與該地區(qū)匹配率高的根瘤菌對(duì)該地區(qū)農(nóng)業(yè)發(fā)展有很大的促進(jìn)作用。生物固氮具有很好的應(yīng)用前景和廣大的發(fā)展空間。本研究通過(guò)對(duì)“南農(nóng)1138-2”大豆品種進(jìn)行蛭石盆栽試驗(yàn)，比較供試根瘤菌株的結(jié)瘤能力、固氮能力和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力，從中篩選出與該品種相匹配的優(yōu)良固氮菌株。以期為根瘤菌菌肥的推廣和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 供試的14株根瘤菌是從皖北不同地區(qū)分離所得。菌種名稱、編號(hào)及來(lái)源詳見(jiàn)表1。

表1 供試菌株一覽表

1.1.2 供試大豆品種 供試大豆品種為南農(nóng)1138-2。

1.1.3 供試蛭石 由安徽科技學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供(用1%的鹽酸浸泡48h，然后用自來(lái)水清洗10遍，直至pH接近中性)。把蛭石裝入高溫滅菌袋中在121℃條件下滅菌2h，得到無(wú)菌蛭石。

1.1.4 培養(yǎng)基 ①斜面培養(yǎng)基(YMA培養(yǎng)基)：甘露醇10g，酵母粉1g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.1g，K2HPO40.5g，瓊脂粉15～18g，水1000mL，pH6.8，在121℃下，滅菌20mim；②液體培養(yǎng)基(YMAB培養(yǎng)基)：甘露醇10g，酵母粉1g，MgSO4·7H2O 0.2g，K2HPO40.5g，NaCl 0.1g，1000mL，pH6.8，在121℃下，滅菌時(shí)間為20min。

1.1.5 Fahraeus無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液 CaCl2·2H2O 0.1g，MgSO4·7H2O 0.12g，KH2PO40.1g，Na2HPO40.15g，檸檬鐵鹽 5mg，Gibson 微量元液 1mL，蒸餾水 1000mL, pH 6.5～7.0，在121℃下，滅菌20min。(Gibson 微量元液配方：H3BO32.86g，ZnSO4·7H2O 0.22g，MnSO4·4H2O 2.03g，NaMOO4·2H2O 0.126g，CuSO4·5H2O 0.08g，蒸餾水 1000mL)。

1.2 方法

1.2.1 根瘤菌培養(yǎng) 將根瘤菌接種到固體YMA斜面培養(yǎng)基上活化，然后轉(zhuǎn)接在YMAB液體培養(yǎng)基中，用搖瓶培養(yǎng)法在28℃,160 r/min條件下，震蕩培養(yǎng)3～4d，備用。

1.2.2 種子萌發(fā)蛭石滅菌 將精選的大豆種子首先用95%的乙醇處理5mim，再用0.1%升汞處理5min，無(wú)菌水沖洗7～8次，鋪平與內(nèi)含無(wú)菌濾紙和少量無(wú)菌水的培養(yǎng)皿中，28℃催芽1～2d，待幼根長(zhǎng)至1cm左右時(shí)栽植。將蛭石包入耐高溫塑料袋中扎好放到高壓滅菌鍋中滅菌(121℃)2h備用。

1.2.3 大豆栽培 將發(fā)芽的大豆根部朝下，用無(wú)菌鑷子夾取，植入裝有無(wú)菌蛭石的塑料花盆(15cm×13cm)中，每盆種植3顆，然后將大豆移到溫室大棚中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔2～3d澆一次無(wú)菌水，并且按每個(gè)塑料盆10mL的量澆無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液(以后隨著植株的生長(zhǎng)，適量的增加澆無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液的量)。待大豆長(zhǎng)出第一片子葉時(shí)，再沿各植株根部加入根瘤菌液2mL，各個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，以不接菌種作為空白對(duì)照，培養(yǎng)40d進(jìn)行規(guī)定指標(biāo)測(cè)定。

1.2.4 接種效果的測(cè)定 待植株長(zhǎng)到40d后進(jìn)行收獲。收獲時(shí)把根部用清水洗干凈，分別測(cè)定根瘤數(shù)、根瘤干重、植株的干重(先在烘箱中120℃殺青40mim，然后在60℃烘干48h，稱重[13])、植株株高，采用凱氏定氮法測(cè)定地上部分植株的全氮量[14]，并對(duì)植株的葉綠素含量進(jìn)行測(cè)定[15]。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 利用DPS1.3軟件的鄧肯氏新復(fù)極差法(SSR)和Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種不同根瘤菌對(duì)大豆生長(zhǎng)的影響

注：同列數(shù)值后不同小、大寫(xiě)字母分別表示處理間差異達(dá)5%和1%顯著水平。

Note：Values followed by different small and capital letters in the same column mean significant at the 5% and 1% levels，respectively。

由表2可以看出，14株根瘤菌處理的植株全部結(jié)瘤，結(jié)瘤數(shù)為5～89個(gè)/盆，除AFL15和AHM6-3兩菌株之外，其余12菌株處理的結(jié)瘤數(shù)明顯高于CK，尤其是菌株ABL9-2、AHM2B 和AWL12-1，分別比CK增加12.7倍、10.8倍和5.4倍，達(dá)到了極顯著和顯著水平；處理后的大多數(shù)根瘤干重高于CK，其中接種菌株AHM2B、ABL9-2和AWL12-1的根瘤干重優(yōu)于其他菌株，根瘤干重分別增加5.3、5.04和4.24倍；對(duì)植株干重影響較顯著的菌株依次是ASF17、AWL26、ABL9-2和AHM2B，分別比空白對(duì)照增加1.27、1.24、1.23和1.22倍；對(duì)植株株高影響較顯著的菌株是AHM2B、AFFZC7、ABL9-2和AWCS13-4，植株分別增高1.31、1.30、1.30和1.29倍。

從上述分析可以看出：接種根瘤菌能夠促進(jìn)植株的生長(zhǎng)，提高植株的結(jié)瘤能力，其中AHM2B和ABL9-2兩種菌株的效果較好。

2.2 接種不同根瘤菌對(duì)植株葉綠素含量和全氮量的影響

表3 接種不同根瘤菌對(duì)植株葉綠素含量和全氮量的影響

注：同列數(shù)值后不同小、大寫(xiě)字母分別表示處理間差異達(dá)5%和1%顯著水平。

Note：Values followed by different small and capital letters in the same column mean significant at the 5% and 1% levels，respectively。

由表3可以看出：接種后植株葉片中葉綠素含量差異很大，與CK比較AWL26、ABL9-2、AHM2B、AFL15 4種菌株處理后植株的總?cè)~綠素含量增加顯著，尤其是菌株AWL26、ABL9-2達(dá)到了極顯著水平。 說(shuō)明這些菌株與植株的匹配性較好，能夠增加植株葉綠素含量，提高光合作用效率；接種不同根瘤菌對(duì)大豆植株中的全氮量的影響存在顯著差異。所有經(jīng)過(guò)菌劑處理的大豆植株全氮量均高于CK。AWL26、AFL15和AHM2B、 ABL9-2處理后的大豆植株全氮量比CK高3.18、2.76、2.72和2.28倍，達(dá)顯著水平，有的甚至達(dá)到了極顯著水平，ASF17和AWL6-4B處理后的大豆植株全氮量也比CK高1.9和2.04倍，其余菌株處理后的大豆植株全氮量高于CK，但增加不顯著。

3 結(jié)論與討論

大豆與大豆根瘤菌之間的共生作用，是在長(zhǎng)期的歷史進(jìn)化中相互作用、相互影響，經(jīng)過(guò)不斷的互相選擇逐漸形成的，是一個(gè)大豆根瘤菌與其宿主之間通過(guò)分子對(duì)話相互識(shí)別的過(guò)程[16]。在這個(gè)過(guò)程中，影響大豆根瘤菌與其寄主共生結(jié)瘤的因素有菌株、大豆品種、環(huán)境溫度、濕度、pH、競(jìng)爭(zhēng)等[17-20]。據(jù)研究表明，根瘤菌的接種率高低主要取決于自身的競(jìng)爭(zhēng)能力，競(jìng)爭(zhēng)能力強(qiáng)的菌株才能充分發(fā)揮接種的效果，固氮能力也就相應(yīng)的越強(qiáng)[21]。另外不同接種方式也影響固氮體系的構(gòu)建[22-23]。因此，共生固氮體系的作用能否充分發(fā)揮取決于多種因素的影響。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中，用根瘤菌劑接種豆科植物，不僅能夠減少含氮肥料的使用，減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，還可以減少環(huán)境污染，符合現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)的發(fā)展需求。所以要充分發(fā)揮高效共生固氮菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)效益，前提是篩選出高效的根瘤菌。為了得到匹配性更高的根瘤菌，還需要進(jìn)一步關(guān)注和研究。

接種高效大豆根瘤菌能夠增加大豆根瘤數(shù)量和固氮量, 增加大豆生長(zhǎng)各個(gè)時(shí)期的氮素供給量, 增加大豆植株干物質(zhì)的積累, 最終達(dá)到使大豆增產(chǎn)的目的[24]，從以上各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果可以看出, 用于本試驗(yàn)的大豆根瘤菌菌株, 都能與皖北地區(qū)種植面積比較廣的大豆品種“南農(nóng)1138-2”進(jìn)行共生匹配、結(jié)瘤固氮, 但固氮結(jié)瘤的能力和對(duì)植物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用, 卻存在著較大的差異。通過(guò)盆栽比較試驗(yàn)，證明在供試的14 個(gè)大豆根瘤菌菌株中, AHM2B、ABL9-2 、AWL26和AFL15這4株大豆根瘤菌，在與 “南農(nóng)1138-2”進(jìn)行的最佳共生匹配試驗(yàn)中，均表現(xiàn)出了良好的共生固氮結(jié)瘤效果, 接種它們的大豆植株在株高、結(jié)瘤數(shù)、瘤干重、植株地上部分干重、葉綠素含量和全氮量等指標(biāo)上, 均明顯地優(yōu)于接種其他根瘤菌菌株, 尤其是菌株AHM2B和ABL9-2，各方面性能都比較優(yōu)良。

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Screening of Superior Soybean Rhizobial Strains in Northern Anhui Province

WU Ping， HE Qing-yuan，LI Zheng-peng， SHI Jun，ZHU Chang-wei

(Institute for Applied Microbiology, Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang 233100，China)

Symbiotic relationship between “Nannong 1138-2” and fourteen soybean rhizobia strains isolated from northern Anhui province was experimented. The results showed that they had the better matching between strains of AHM2B, ABL9-2, AWL26 and AFL15 and Nannong 1138-2. Thereinto, total nodule number, nodule dry weight, plant dry weight and plant height were greatly influenced by inoculated strains AHM2B and ABL9-2. Chlorophyll and total nitrogen content were significantly increased by inoculated strains of AATB26and AFL15. To sum up, two strains of AHM2B and ABL9-2 show better symbiotic relationship than other strains.

Soybean；Rhizobium；Screening；Symbiotic nitrogen-fixing

2015-05-10

安徽省教育廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(KJ2011Z066)；安徽科技學(xué)院自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZRC2013367)；安徽科技學(xué)院生物學(xué)重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科項(xiàng)目(AKXK20102-1)。

吳萍(1958-)，女，安徽省五河縣人，教授，主要從事生物肥料研究。

S565.1

A

1673-8772(2015)04-0018-05