人輪狀病毒疫苗的研究進(jìn)展

張改梅,魏文進(jìn),付作申

人輪狀病毒疫苗的研究進(jìn)展

張改梅,魏文進(jìn),付作申

輪狀病毒(RV)是引起全球5歲以下嬰幼兒腹瀉最重要的病原之一，普遍流行于發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家，然而在發(fā)展中國家該病的病死率較高。由于目前RV腹瀉尚無有效治療藥物，并且改善衛(wèi)生條件對預(yù)防RV感染并無明顯的效果。因此，疫苗是目前證實(shí)能預(yù)防和控制RV腹瀉唯一有效的手段。盡管RV疫苗研制已取得很大的進(jìn)展，由于輪狀病毒毒株的多樣化和流行分布很廣，故而繼續(xù)研制一種新的適合的安全、有效的RV疫苗顯得尤為重要。本文針對人RV疫苗的研究進(jìn)展、質(zhì)量控制、保護(hù)效力及安全性評價作一綜述，以期促進(jìn)后期相關(guān)研究。

人輪狀病毒；疫苗進(jìn)展；質(zhì)量控制;保護(hù)效力;安全性

輪狀病毒(Rotavirus, RV)是全球嬰幼兒嚴(yán)重腹瀉的重要病原因子，主要感染3月齡到5歲的兒童，其感染率可達(dá)30%～65%[1]，其中6月齡到2歲的兒童中發(fā)生中度和重度感染最多。該病無季節(jié)性，全年均可發(fā)生感染，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報告顯示，在2008年時全球約有45.3萬兒童死于輪狀病毒胃腸炎(RVGE)，約占全部死亡兒童的5%，5歲以下兒童的死亡率為86/10萬[3]。約90%的輪狀病毒死亡者來自亞非等經(jīng)濟(jì)、衛(wèi)生欠發(fā)達(dá)國家，其中中國輪狀病毒腹瀉死亡率占全球8%。此外，我國各省、市均有報道輪狀病毒暴發(fā)流行的記載[4]。輪狀病毒腹瀉不僅危害人類生命健康，也對社會和家庭造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，在2009年，WHO建議所有成員國將RV疫苗納入其兒童計劃免疫程序中，尤其是腹瀉死亡率占5歲以下兒童總死亡率達(dá)到10%以上的國家[3]。目前，市售的RV疫苗雖然能對重癥腹瀉起到良好的保護(hù)作用，但卻不能很好地預(yù)防RV感染。本文對RV、RV疫苗的研究進(jìn)展及疫苗的保護(hù)效率和安全性評價作一綜述。

1 輪狀病毒的結(jié)構(gòu)特征

RV是一種雙鏈RNA病毒，屬于呼腸孤病毒科。病毒顆粒由3層組成，由VP2作為內(nèi)層骨架，VP1和VP3裝配其中，并且包裹著11個基因片段，分別編碼6個結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP4、VP6和VP7)和5個非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1～NSP5)。中殼由VP6構(gòu)成22～24個輻條狀結(jié)構(gòu)。根據(jù)VP6的抗原特異性，輪狀病毒可分為A、B、C、D、E、F、G7個抗原群，而人類可被前3個群感染，其中A群是引起嬰幼兒腹瀉的主要病原。不同群之間并沒有交叉保護(hù)作用。光滑外殼由VP7和VP4組成，它們是輪狀病毒最重要的抗原成分，因此與輪狀病毒感染免疫和研制疫苗直接相關(guān)。VP7血清型稱為G型，A群目前有14個G型，其中G1、G2、G3、G4、G5、G6、G8、G9、G10、G12共10個G型均在嬰幼兒輪狀病毒腹瀉糞便中檢出。VP4血清型稱為P型，P型超過20個，其中8個P型與人類有關(guān)。到目前為止，G1～G4型仍然是發(fā)病人群中的優(yōu)勢流行株[1-2]。近年來，在亞洲、澳洲和南美洲，G9和G10型在人群中有增多趨勢，并且混合感染非常嚴(yán)重。

2 VP7的遺傳變異情況

VP7由第9基因片段編碼，是一種N-高甘露糖型糖蛋白，約占病毒蛋白總量的30%。VP7是決定型特異性和誘導(dǎo)中和抗體的主要抗原，在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。VP7基因變異主要表現(xiàn)為堿基替換，在58、97、302、458、699、742、882和930處容易發(fā)生變異。研究表明，同一血清型中變異較小，而不同血清型間存在較大的變異。由于RV血清型別多樣，并且優(yōu)勢流行株在不斷更新和變化，目前尚沒有研究顯示在受到一種血清型RV感染后能夠激發(fā)免受其它血清型病毒的再次感染。因此，研制一種包括人輪狀病毒最常見的幾個型別的多價RV疫苗是目前的主流方向。

3 國內(nèi)外輪狀病毒疫苗的發(fā)展概況

3.1 人用動物輪狀病毒單價活疫苗 關(guān)于輪狀病毒疫苗的研究始于20世紀(jì)70年代中期，最早的RV疫苗是牛RIT4237株疫苗(NCDV)，鑒于該疫苗在不同國家和地區(qū)的保護(hù)效果非常不一致，故被停用[1,3]。此外，Clark等用G6型牛輪狀病毒W(wǎng)C3株研發(fā)的WC3疫苗和Kapikian等用G3型猴輪狀病毒株MMU18006(RRV)研發(fā)的RRV株疫苗進(jìn)行臨床試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)其保護(hù)效果迥異，均被停用[7]。之后，白植生等用羊輪狀病毒株G10P[12]型LLR株研發(fā)的人用口服輪狀病毒活疫苗，該疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生廣泛的中和抗體，陽轉(zhuǎn)率高達(dá)60%，對RV腹瀉的保護(hù)效果為78%，并且在使用中尚未發(fā)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)[1,7]。故LLR株疫苗成為世界上第1個獲得批準(zhǔn)生產(chǎn)的以動物輪狀病毒株制備的人用輪狀病毒活疫苗。

3.2 人-動物輪狀病毒基因重配株多價活疫苗

3.2.1 人-猴輪狀病毒基因重配株四價活疫苗 1985年kapikian等以猴輪狀病毒RRV株為親本，將人輪狀病毒G1、G2和G4型的VP7基因片段插入親本組成重配株即四價活疫苗(RRV-TV)[8]。RRV-TV經(jīng)7次臨床觀察結(jié)果表明，對所有輪狀病毒腹瀉的保護(hù)效果達(dá)到47%～69%，對重度腹瀉保護(hù)率可達(dá)70%～100%。于1998年經(jīng)FDA批準(zhǔn)可以正式生產(chǎn)上市，并被列入兒童常規(guī)預(yù)防接種計劃。RRV-TV成為世界上經(jīng)批準(zhǔn)注冊的第一個用于嬰幼兒的RV重配株活疫苗。后期由于腸套疊事件的發(fā)生，故被停止生產(chǎn)。

3.2.2 人-牛輪狀病毒基因重配株四價活疫苗 美國Wistar學(xué)者以牛輪狀病毒W(wǎng)C3株為親本，通過基因重配獲得人-牛輪狀病毒基因重配株四價活疫苗(WC-QV)。臨床觀察表明，該疫苗對輪狀病毒腹瀉的保護(hù)效率達(dá)到67%，對重型輪狀病毒腹瀉達(dá)到69%[6-8]。另外，有學(xué)者以牛輪狀病毒UK株為親本，通過基因重配獲得人輪狀病毒VP7單基因片段基因重配株組成人-牛輪狀病毒四價活疫苗(UK-QV)[7]，在美國對不同年齡人群進(jìn)行了臨床觀察，結(jié)果顯示該疫苗可以與其它疫苗聯(lián)合使用[9]。

3.2.3 人-羊輪狀病毒基因重配株三價活疫苗 蘭州生物制品研究所以LLR疫苗為基礎(chǔ)，采用G2、G3和G4型人RV分別與LLR株進(jìn)行重配，從而獲得人-羊基因重配株三價活疫苗。該疫苗于2007年5月獲SFDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，目前正在進(jìn)行Ⅲ期臨床試驗(yàn)[8-9]。

3.2.4 人-牛輪狀病毒基因重配五價活疫苗 美國FDA批準(zhǔn)默沙東(MSD)公司的五價人-牛重配RV疫苗(RotaTeq)，該疫苗是以WC3為親本的重配株，包括人(G1，VP7)、(G2，VP7)、(G3或G4，VP7)、牛(P7[5]，VP4)，以及人(P1A[8]型，VP4)或牛(G6，VP7)。該疫苗可以有效預(yù)防G1～G4型RV引起的嬰幼兒胃腸炎，保護(hù)率為74%。對嚴(yán)重腹瀉的免疫效率為98%[6,9]。

3.3 人源輪狀病毒口服活疫苗 由澳大利亞學(xué)者用RV3株研發(fā)的疫苗， II 期臨床結(jié)果顯示，在服完3劑疫苗后，血清中IgA 的水平比較低，但受試者能在下一年度免受輪狀病毒感染[11]。1998年，Bernstein等報告的89-12株(G1型)疫苗，經(jīng)臨床觀察，19%的受試者在第1次服用后會發(fā)生發(fā)熱等副反應(yīng)，但口服2次后，疫苗的免疫效果高達(dá)94%，成為目前輪狀病毒疫苗中的高效疫苗[12]。2005年葛蘭素史克(GSK)公司生產(chǎn)的單價人RV減毒活疫苗(Rotarix)(G1P[8])，對大多數(shù)血清型RV可產(chǎn)生交叉保護(hù)作用[10,12]。越南研制的單價人輪狀病毒疫苗RotavinTM(G1P[8])具有良好的免疫原性并在2012年4月獲準(zhǔn)使用[12-13]。

另外，IGV-80-3冷適應(yīng)株人輪狀病毒(G1型)，傳代培養(yǎng)溫度已降低至25 ℃，此侯選珠正在進(jìn)行Ⅰ期臨床觀察[1]。

3.4 輪狀病毒新型疫苗

3.4.1 基因工程亞單位疫苗與病毒樣顆粒(VLP) Meccrea等于1987年成功獲得了重組蛋白VP7，免疫動物后能夠產(chǎn)生特異的高滴度的免疫抗血清[14]。目前通過基因重組技術(shù)已制備出RV主要結(jié)構(gòu)蛋白VP2、VP4、VP6、VP7。其優(yōu)勢在于使用過程中無病毒復(fù)制，更加安全，但亞單位疫苗最大的缺點(diǎn)是起不到內(nèi)生性抗原的免疫效果；其次，不能有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生粘膜免疫，而預(yù)防輪狀病毒感染恰恰需要腸道的局部免疫。

病毒樣顆粒(VLPs)由于沒有感染性，作為免疫原，通過遞呈免疫細(xì)胞，能有效誘導(dǎo)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)[15]。目前，已運(yùn)用重組腺病毒表達(dá)載體和重組桿狀病毒載體，成功表達(dá)產(chǎn)物自組裝成VLPs，如人類乳頭瘤病毒樣顆粒(HPV-VLPs)四聯(lián)苗(HPV6/11/16/18)已于2006年在歐洲上市，具有廣泛的交叉保護(hù)作用[15,17]。輪狀病毒猴SA11-2/6株用桿狀病毒表達(dá)載體最終組裝成功VP2/6病毒樣顆粒，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生血清中和抗體[18]。另外，還可以組裝含有VP4和VP7的雙層病毒空殼顆粒。VLPs疫苗沒有感染性，穩(wěn)定性好，不易失活，具有廣闊的發(fā)展前景[19-20]。VLPs通常與佐劑共用，以獲得最好的免疫應(yīng)答，研究發(fā)現(xiàn)，VLP與QS21佐劑共用時，血清中和抗體滴度顯著高于SA11株免疫效果[1,14]。

3.4.2 核酸疫苗 Greenberg等將編碼鼠RV VP4、VP6、VP7基因插入表達(dá)質(zhì)粒pCMV中，成功構(gòu)建了重組串聯(lián)質(zhì)粒，作為多價核酸疫苗，注入機(jī)體后，能夠在活體中成功表達(dá)RV重要抗原，并具有較好的交叉免疫保護(hù)作用，這表明DNA疫苗可能是控制RV腹瀉的一種新方法[7,14]。核酸疫苗能夠規(guī)避減毒活疫苗的致病風(fēng)險，但其缺點(diǎn)是免疫原性較低，且過程復(fù)雜，技術(shù)難度大，成本費(fèi)用較高。

3.4.3 轉(zhuǎn)基因植物疫苗 自20世紀(jì)90年代起，隨著高效基因載體和基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展，以植物特別是農(nóng)作物作為表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)人用疫苗或功能蛋白，打破了傳統(tǒng)疫苗或功能蛋白的生產(chǎn)方式[21-22]。這種將抗原基因整合于植物體上或重組于載體后轉(zhuǎn)染于植物體上，利用植物體自身的生命活動，生產(chǎn)出相應(yīng)的抗原蛋白，即為轉(zhuǎn)基因植物疫苗。此外，免疫途徑也將采用直接食用或加工后口服植物(果實(shí))，即可食性疫苗(口服疫苗)。目前，該項研究多處于臨床前研究階段，僅有少數(shù)進(jìn)入了臨床期試用[23]。由于利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)重組蛋白，轉(zhuǎn)化為植株的種子易于儲存，還解決了以往大腸桿菌系統(tǒng)、酵母系統(tǒng)和哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)生產(chǎn)疫苗所面臨的難題，故而擁有著潛在的優(yōu)勢和廣闊的發(fā)展前景。

目前已建立了煙草、馬鈴薯、番茄、香蕉等多種轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)，并且乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、鏈球菌屬突變株表面蛋白(spaA)等多種疫苗已成功獲得了表達(dá)[21-25]。其中乙型肝炎表面抗原在煙草中的表達(dá)為可溶性的，表達(dá)量為總蛋白的0.01%。經(jīng)過免疫小鼠后體內(nèi)產(chǎn)生高水平的乙肝病毒特異性抗體，人食用后體內(nèi)也產(chǎn)生抗乙肝病毒特異的IgG抗體。Richter等用商業(yè)來源的乙肝疫苗對小鼠進(jìn)行初免后，再用轉(zhuǎn)基因馬鈴薯表達(dá)的乙肝疫苗經(jīng)腹腔注射加強(qiáng)免疫，結(jié)果顯示免疫應(yīng)答得到高度加強(qiáng)[23,25]。但是，如何提高轉(zhuǎn)基因植物的抗原蛋白產(chǎn)量，是目前該技術(shù)的一大難題。如通過改進(jìn)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，采用強(qiáng)啟動子、增強(qiáng)子來促進(jìn)抗原蛋白表達(dá)。再者，進(jìn)一步擴(kuò)大可食性轉(zhuǎn)基因植物疫苗的植物范圍，也是一條很好的途徑[26-27]。

運(yùn)用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)疫苗，不需要昂貴的設(shè)備，在獲得高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株后，擴(kuò)大耕地面積，就能獲得大量的疫苗，該種生產(chǎn)疫苗的方式不僅安全可靠，而且成本低廉，對于第三世界國家是一大福音，人類和動物可避免免疫注射之苦，同時也節(jié)省了大量人力、物力。生產(chǎn)并接種這種“可食用疫苗”為輪狀病毒疫苗的研究和發(fā)展開拓了更廣闊的前景。

3.4.4 其它新型疫苗 研究表明非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4是一種病毒性腸毒素，與RV腹瀉有直接關(guān)系，故研制出抗NSP4的單克隆抗體，可以作為靶標(biāo)，對RV治療具有重要意義。另外，通過表達(dá)的重組NSP4蛋白免疫機(jī)體，可以產(chǎn)生特異性的抗NSP4 IgG和IgA抗體，為RV新疫苗研制提供一種新的途徑[28]。

4 輪狀病毒疫苗的質(zhì)量控制評價

在輪狀病毒疫苗質(zhì)量控制中，病毒滴度測定是關(guān)鍵性評價指標(biāo)，如疫苗的生產(chǎn)工藝、保護(hù)效果、有效期、安全性和批內(nèi)批間穩(wěn)定性評價都依賴于病毒滴度的測定。但由于輪狀病毒疫苗效價與抗原濃度無關(guān)，目前尚無非常準(zhǔn)確規(guī)范的方法來進(jìn)行評價[28-29]。并且輪狀病毒細(xì)胞病變不典型，無法用國際通用的病毒滴度測定方法——蝕斑法，我國唯一上市的輪狀病毒疫苗LLR采用CCID50法和ELISA法聯(lián)合使用來代替肉眼判斷病變情況，但其重復(fù)性和可靠性尚有待考證，該產(chǎn)品上市十多年，但目前尚未入我國藥典。另外，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)、熒光灶法、CCID50結(jié)合免疫染色法也已用于病毒滴定測定，但尚未得到廣泛認(rèn)可。因此，亟需進(jìn)一步摸索來確定輪狀病毒滴度測定的通用標(biāo)準(zhǔn)方法，為疫苗的質(zhì)控提供重要評價標(biāo)準(zhǔn)。

5 輪狀病毒疫苗的保護(hù)效力評價

RotarixTM對大多數(shù)其他血清型RV可產(chǎn)生交叉保護(hù)。在北美的臨床觀察顯示，RotarixTM預(yù)防嚴(yán)重RV胃腸炎的保護(hù)率為84.7%，嚴(yán)重胃腸炎住院率下降了85%。RotaTeqTM對G1～G4型RV導(dǎo)致的胃腸炎和嚴(yán)重胃腸炎的保護(hù)效率分別為74%和98%[28,30]。在美國的臨床觀察中，RotaTeqTM對嚴(yán)重的輪狀病毒腹瀉保護(hù)率達(dá)到85%～95%，并且自上市以來，過去的幾個流行季輪狀病毒活躍度均在下降，表明RotaTeqTM可能具有潛在的群體免疫效應(yīng)。我國生產(chǎn)上市的LLR可誘導(dǎo)產(chǎn)生G1～G4型血清中和抗體，陽轉(zhuǎn)率達(dá)40%～60%，對RV腹瀉的保護(hù)率達(dá)78%[28,33]。截止2011年9月，全球已有28個國家將輪狀病毒疫苗納入了計劃免疫中，其中16 個國家使用RotarixTM，8個國家使用RotaTeqTM，有4 個國家同時使用兩種疫苗，但是還沒有亞洲國家將其納入計劃免疫[29-30]。全球調(diào)查資料顯示，輪狀病毒疫苗接種可以保護(hù)非計劃免疫適齡兒童，對于欠發(fā)達(dá)地區(qū)實(shí)行計劃免疫將有利于保證疫苗群體效力和覆蓋率[29,32]。

6 安全性評價

6.1 腸套疊風(fēng)險 1999年7月，美國疾病預(yù)防控制中心(CDC)在首次服用RotashieldTM疫苗的兒童中監(jiān)測到15例腸套疊病例[34]。同年，美國FDA停止了RotashieldTM的生產(chǎn)和應(yīng)用。目前大量臨床觀察表明，墨西哥和澳大利亞報告接種首劑后腸套疊風(fēng)險會增加，而巴西報告在第2次接種后該風(fēng)險會增加，但美國卻沒有監(jiān)測到此風(fēng)險[34-36]。然而，RotashieldTM與腸套疊相關(guān)聯(lián)，可能僅與其自身結(jié)構(gòu)相關(guān)，而并非所有口服RV活疫苗的共性。盡管腸套疊的問題尚未解決，但RV疫苗的好處遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于腸套疊的風(fēng)險帶來的弊端。另外，WHO已建議發(fā)展中國家取消對輪狀病毒疫苗接種的年齡限制，使得這些國家在提高疫苗覆蓋率方面運(yùn)作更加靈活便捷，但同時也強(qiáng)烈建議這些地區(qū)實(shí)行對腸套疊的監(jiān)測，從而有效提升RV疫苗的安全性[37-38]。

6.2 外源物質(zhì)的污染 2010年，美國FDA稱RotarixTM中檢出豬圓環(huán)病毒Ⅰ型的DNA片段。同年，F(xiàn)DA也證實(shí)在RotaTeqTM中也存在豬圓環(huán)病毒Ⅰ型和Ⅱ型的DNA片段[39]。盡管PCV1不會對人類生命造成威脅，卻使得疫苗生產(chǎn)質(zhì)量難以控制。此外，RotaTeqTM疫苗中還發(fā)現(xiàn)了猴逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA片段[39-40]。對外源因子進(jìn)行監(jiān)測，是疫苗的質(zhì)量和安全的重要保障。實(shí)行毒(菌)種關(guān)鍵基因的測序和降低在細(xì)胞培養(yǎng)中抗生素的使用量是控制疫苗安全的有效手段。

7 展 望

自輪狀病毒被發(fā)現(xiàn)四十多年來，相關(guān)的疫苗研究進(jìn)展迅速，但是已經(jīng)獲得批準(zhǔn)注冊的RV疫苗和有望研制成功的RV疫苗都是口服RV活疫苗。由于輪狀病毒的感染免疫機(jī)制尚未完全闡明[41]，不同血清型之間缺乏有效的交叉保護(hù)作用，同時，新流行毒株的不斷出現(xiàn)，這些都為新疫苗的研發(fā)與應(yīng)用提出了挑戰(zhàn)。隨著輪狀病毒各領(lǐng)域研究的不斷發(fā)展及新技術(shù)、新方法的不斷涌現(xiàn)，輪狀病毒疫苗的研究方向也將更加廣闊。口服輪狀病毒活疫苗的研究仍然是近期研究的主要方向。疫苗將向更多價發(fā)展，可能包括G5、G8、G9、G10、G12等一些近年來呈優(yōu)勢流行趨勢的血清型[41-42]。對輪狀病毒疫苗接種途徑和接種方法的研究可能對輪狀病毒疫苗的研究產(chǎn)生重要影響。輪狀病毒亞單位疫苗及病毒樣顆粒疫苗的研究將越來越受到重視。其它新型疫苗的研究，如基因工程疫苗、核酸疫苗、NSP4的作用等為未來輪狀病毒疫苗的研發(fā)開辟了新途徑。

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Fu Zuo-shen; Email: fuzuoshen@163.com

Progresses on human rotavirus vaccine

ZHANG Gai-mei,WEI Wen-jin,FU Zuo-shen

(BeijingMinhaiBiotechnologyCO.LTD,Beijing102600,China)

Rotavirus is a primary pathogen of infantile diarrhea under the age of five. Rotavirus infection is very popular in developed and developing countries, with similar morbidity, but the mortality is higher in developing countries. There has been no effective treatment at present and further improvement in hygiene to control the spread of rotavirus. So developing safe and effective vaccine is the best way for prevention of rotavirus diarrhea, in order to effectively reduce the morbidity and mortality. Although great progress has been achieved in rotavirus vaccine development, there are still many problems (such as the diversity and wide distribution of rotavirus) in the current rotavirus vaccines industry. Therefore, it's of great importance to develop sequentially navel rotavirus vaccine. The research progresses in human RV vaccine, quality control, protective efficiency and safety evaluation are reviewed in this paper for the pathogenic characteristics and the immune mechanism of the rotavirus.

human rotavirus vaccine; progress of vaccine research; quality control, protective efficiency; safety

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10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.019

R186

A

1002-2694(2015)06-0583-06

2014-08-25；

2015-03-12