兒童散發(fā)性腎病綜合征致病基因篩查策略的探討

李國民 沈 茜 徐 虹 方曉燕 翟亦暉 孫 利 劉海梅 饒 佳 陳 徑 吳冰冰 高學武 安 宇

兒童散發(fā)性腎病綜合征致病基因篩查策略的探討

李國民1,4沈 茜1,4徐 虹1方曉燕1翟亦暉1孫 利1劉海梅1饒 佳1陳 徑1吳冰冰2高學武3安 宇3

目的 通過兒童散發(fā)性腎病綜合征(NS)致病基因及其突變特點，探討兒童NS致病基因的篩查策略。方法 收集復旦大學附屬兒科醫(yī)院腎臟風濕科2011年1月1日至2013年12月31日的所有住院NS患兒的臨床資料,依據(jù)發(fā)病年齡分為先天性NS(3月齡內(nèi))、嬰兒型NS(～12月齡)、兒童早發(fā)型NS(～5歲)和兒童遲發(fā)型NS(～14歲)；對兒童早發(fā)型和遲發(fā)型NS再依據(jù)對糖皮質(zhì)激素(GC)治療反應分為GC敏感(SSNS)和GC耐藥(SRNS)，SRNS又分為初發(fā)型和遲發(fā)型SRNS。先天性NS行NPHS1、NPHS2、PLCE1、LAMB2、LMX1B、COQ2基因所有外顯子和WT1基因8、9外顯子直接測序；嬰兒型NS行NPHS1、NPHS2、PLCE1基因所有外顯子和WT1基因8、9外顯子直接測序；兒童早發(fā)型和遲發(fā)型NS行NPHS2基因所有外顯子和WT1基因8、9外顯子直接測序，以及NPHS1等8個基因42個常見突變位點的SnapShot分析。結(jié)果 238例NS患兒進入本文分析，男139例。①8/10例(80%)先天性NS患兒檢出NPHS1基因致病性突變；②12例嬰兒型NS患兒檢出3例WT1(25.0%)、2例NPHS2(16.7%)和1例NPHS1(8.3%)基因突變；③8/132例(6.1%)早發(fā)型NS患兒檢出基因突變，均屬于初發(fā)型SRNS(8/32，25.0%)，其中WT1 3例(9.4%)、NPHS2 2例(6.3%)、NPHS1 2例(6.3%)和INF2 1例(3.1%)，19例遲發(fā)型SRNS和81例SSNS患兒均未檢出相關(guān)基因突變；④84例兒童遲發(fā)型NS中未檢出基因致病性突變。結(jié)論 先天性NS、嬰兒型NS和兒童早發(fā)型NS中的初發(fā)型SRNS患兒應是臨床基因篩查的對象。NPHS1是本文先天性NS患兒的主要致病基因，推薦在先天性NS患兒行NPHS1基因檢測。NPHS1、NPHS2和WT1基因突變頻率在嬰兒型NS和兒童早發(fā)型NS中的初發(fā)型SRNS患兒中較高，推薦這些人群中優(yōu)先選擇這3個基因作為目標基因進行篩查。不推薦常規(guī)在SSNS和遲發(fā)型SRNS患兒中行基因檢測。

兒童； 腎病綜合征； 致病基因； SnapShot分析； 直接測序

腎小球足細胞和基底膜相關(guān)分子編碼基因突變所引起的腎病綜合征(NS)稱為遺傳性NS[1～5]。遺傳性NS不僅對激素耐藥，而且對各種免疫抑制劑均耐藥[2, 6]，易快速進展為終末期腎病(ESRD)，預后較非遺傳性NS患兒差[7]。但遺傳性NS患兒進展為ESRD后，腎移植腎小球疾病的復發(fā)率較非遺傳性NS低(8%vs38%)[2, 8, 9]。對激素耐藥NS(SRNS)患兒選擇免疫抑制劑治療和ESRD腎移植前應將遺傳性NS患兒篩選出來，以期為SRNS患兒提供個體化治療。兒童NS致病基因國外研究較多，已初步建立了兒童NS致病基因突變譜[10～12]，但國內(nèi)研究較少，且報道的研究樣本不大，尚不能清楚反映中國兒童NS致病基因突變譜，故也無理想的NS致病基因篩查策略。本文收集復旦大學附屬兒科醫(yī)院(我院)近3年所有NS患兒臨床資料和外周血標本，利用候選基因直接測序和SnapShot技術(shù)對已知突變位點檢測，對發(fā)現(xiàn)的變異進行生物信息學分析，確定變異是否為致病性突變，以此來反映不同NS分型行目標基因檢測的策略。

1 方法

1.1 倫理和知情同意 本研究獲我院倫理委員會同意。本研究需獲得NS患兒家長書面同意，對在NS患兒中發(fā)現(xiàn)的突變位點，需得到監(jiān)護人同意情況下，在其家系中驗證。

1.2 NS診斷標準 NS診斷標準參照中華醫(yī)學會兒科學分會腎臟病學組制定的小兒腎小球疾病臨床分類及腎病綜合征治療方案[13]，SRNS是指足量激素(2 mg·kg-1·d-1)治療8周，尿蛋白未能轉(zhuǎn)陰。

1.3 納入標準 2011年1月1日至2013年12月31日在我院腎臟風濕科住院的、年齡<14歲的符合NS診斷的患兒。

1.4 排除標準 ①已證實的繼發(fā)性NS，如各類病原體(HBV、HBC、HIV、梅毒)感染所引起的NS，過敏性紫癜、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、血管炎等系統(tǒng)性疾病引起的NS；②有腎臟病家族史；③患兒家屬不同意參加本研究。

1.5 觀察指標 發(fā)病年齡、性別、出生史、母親妊娠史、激素治療反應、基因型的確定和ESRD進展情況。

1.6 NS分型 依據(jù)NS發(fā)病年齡分為先天性(0～3月齡)、嬰兒型(～12月齡)、兒童早發(fā)型(～5歲)和兒童遲發(fā)型(～14歲) 。依據(jù)激素治療反應分為SRNS和激素敏感NS(SSNS)，SRNS進一步分為初發(fā)型(初始足量激素治療8周，尿蛋白未能轉(zhuǎn)陰)和遲發(fā)型(初始足量激素治療8周內(nèi)尿蛋白轉(zhuǎn)陰，復發(fā)后激素治療8周尿蛋白未能轉(zhuǎn)陰[14, 15])。SSNS進一步分為初發(fā)治療敏感、非頻復發(fā)、頻復發(fā)和激素依賴。

1.7 基因測序

1.7.1 基因突變位點的選擇 如圖1所示[16]。

1.7.2 基因測序方法 用EDTA抗凝管采集外周血2 mL，采用QIAGEN公司(德國)的血液基因組DNA提取試劑盒抽提外周血基因組DNA，直接測序(Sanger法)和SnapShot技術(shù)行基因分型。直接測序應用基因組DNA分別擴增候選基因外顯子及其側(cè)翼序列，擴增引物參照已報道的文獻[17～21]，使用ABI 3730 DNA分析儀(美國ABI公司)行雙向直接測序分析。

圖1 基因突變位點選擇

Fig 1 Selection of gene mutations

SnapShot技術(shù)基因分型根據(jù)不同突變位點，利用primer3 在線軟件 (http：//frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) 分別設計多重PCR 引物和延伸引物，42個突變位點分為panel A、B、C組擴增(有關(guān)擴增引物及其延伸引物限于篇幅不在文中給出，如有需要可與本文作者聯(lián)系)； 利用在線軟件Mfold (http：//bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/mfold-simple.html)行引物和擴增產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)的預測(包括穩(wěn)定性和融解溫度)；應用美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI) 數(shù)據(jù)庫中BLAST行結(jié)構(gòu)特異性檢測，同時使用AutoDimer 軟件對發(fā)夾結(jié)構(gòu)和引物二聚體進行檢測。多重PCR產(chǎn)物在ABI 3130基因分析儀(USA)上毛細管電泳，結(jié)果數(shù)據(jù)用GeneScanTM軟件(Applied Biosystems)分析，陽性結(jié)果再用Sanger法驗證。

1.7.3 序列分析 采用Chromas 2-31和Vector NTI Advance 10軟件行序列分析和序列比對，序列比對時參照NCBI基因數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)提供的核苷酸序列和 cDNA序列參照。氨基酸序列參照Uni-ProKB (http://www.uniprot.org/ ) 和the Ensemble Genome Browser (http://www.ensembl.org/)提供的序列。變異致病性分析流程見圖2。

圖2 變異致病性分析流程圖

Fig 2 Flow chart of disease-causing analysis of variation

Notes 1)NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, UCSC: http://genome.ucsc.edu/, HGMD: http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php; 2) SFIT: http://sift.jcvi.org/, PolyPhen:http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml, http://genes.mit.edu/burgelab/maxent/Xmaxentscan_scoreseq_acc.html

2 結(jié)果

2.1 一般情況 研究期間共收治NS患兒305例，排除狼瘡性腎炎39例、紫癜性腎炎18例、系統(tǒng)性血管炎3例、家族性NS 4例、急性腎小球腎炎2例、患兒家長不同意參與研究2例，238例NS患兒進入本文分析，男139例，女99例。先天性NS 10例，嬰兒型NS 12例，兒童早發(fā)型NS 132例(SRNS 51例，SSNS 81例)；兒童遲發(fā)型NS 84例(SRNS 34例，SSNS 50例)。基因檢測情況如表1所示。

2.2 先天性NS 10例先天性NS中，男4例。例1出生時胎盤重量>體重25%，2例為早產(chǎn)，均無其他癥狀(表2)。8例存在NPHS1基因雙雜合突變，其中例4和6家系NPHS1突變分析發(fā)現(xiàn)，其雜合突變分別來自其父母，屬于復合雜合突變(圖3A和B)；余6例未采集父母的血樣行家系NPHS1突變分析。錯義突變通過在線軟件SFIT和PolyPhen預測均為有害性突變，保守性分析也提示其具有保守性(表3)。其中p.R268X、p.C528G、p.Q930X、p.Q1071fsX1142、IVS12+1C>A、p.Q1148fsX1179、p.D310N、IVS26DS-2A>T、p.R711G、p.T517K 和 p.S520L 為新發(fā)現(xiàn)的突變。10例先天性NS患兒均未檢出NPHS2、PLCE1、LAMB2、LMX1B、COQ6和WT1基因突變。

表1 238例散發(fā)性NS患兒相關(guān)致病基因突變分析[n(%)]

表2 10例先天性NS患兒的臨床資料和NPHS1突變分析

Notes F: female, M: male; w: weeks; m: months; GA: gestational age; Proteinuria: g·24 h-1；ALB：g·L-1

圖3 先天性NS患兒家系NPHS1基因檢測圖

Fig 3 Mutations ofNPHS1 gene in patients with congenital nephrotic syndrome

Notes A:case 4，B: case 6. The upper, midder and lower panel represented patient, and his (or her) father and mother, respectively

表3NPHS1和NPHS2基因錯義突變的功能分析

Tab 3 Function analysis of missense mutations ofNPHS1 andNPHS2 genes

LocationAminoacidsubstitutionFunctionaleffectPolyPhenSIFTMutationanalysisConser-vationNPHS1genec.1784C>Gp.R595PDamagingDeleteriousNewYesc.928G>Ap.D310NDamagingDeleteriousNewYesc.1528A>Cp.C528GDamagingDeleteriousNewYesc.1550G>Tp.T517KDamagingDeleteriousNewYesc.1559G>Ap.S520LDamagingDeleteriousNewYesc.2131C>Gp.R711GDamagingDeleteriousNewYesc.2788C>Tp.Q930XDamagingDeleteriousNewYesc.349G>Ap.E117KDamagingDeleteriousNoYesNPHS2genec.497A>Gp.D166GDamagingDeleteriousNewYesc.215G>Tp.G72VBenignNeutralNew/denovoYes

2.3 嬰兒型NS 表4顯示，12例嬰兒型NS中，男女各6例，11例表現(xiàn)為SRNS初發(fā)型，1例為SSNS。4例有腎外癥狀，2例進展為ESRD。嬰兒型NS中1例NPHS1和2例NPHS2基因突變均為雙雜合突變，3例WT1基因突變?yōu)閱蝹€雜合突變。p.D166G錯義突變通過在線軟件SFIT和PolyPhen預測均為有害性突變，保守性分析也提示其具有保守性(表3)，ISV 8+5G>A經(jīng)在線軟件預測為有害性突變。 p.D166G和ISV 8+5G>A為新發(fā)現(xiàn)的突變。由于例4有髕骨發(fā)育不良，還行LMX1B突變分析，未發(fā)現(xiàn)致病性突變。12例嬰兒型NS均未檢出PCLE1基因突變。

2.4 兒童早發(fā)型NS 132例兒童早發(fā)型NS中，男78例，女54例，平均年齡3.8歲，SRNS 51例(初發(fā)型32例，遲發(fā)型19例)，SSNS 81例(初發(fā)治療敏感23例，非頻復發(fā)16例，頻復發(fā)或激素依賴42例)。初發(fā)型SRNS 32例中，微小病變12例、系膜增生性腎小球腎炎8例，局灶節(jié)段性腎小球硬化7例，局灶增生性腎炎3例，2例未做腎活檢；遲發(fā)型SRNS 19例中，微小病變9例、系膜增生性腎小球腎炎3例、局灶增生性腎炎2例，局灶節(jié)段性腎小球硬化2例，3例未做腎活檢。8/132例(6.1%)兒童早發(fā)型NS檢出基因突變(表5，圖4)，均為初發(fā)型SRNS，2例NPHS1基因突變和1例INF2突變通過SnapShot分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Sanger法驗證(圖4D)，同時還發(fā)現(xiàn)2例NPHS1基因突變患兒還檢出p.E117K突變(圖4C)。p.E117K突變雖在正常人群頻率較高，但通過在線軟件突變功能預測、保守性分析提示為有害性突變可能(表3和圖5A)。盡管NPHS2基因p.G72V突變經(jīng)在線預測軟件為良性突變或中性突變(表3)，但該位點具有保守性(圖5B)，家系突變分析為denovo突變，不排除其致病可能。

表5 8例兒童早發(fā)型NS的基因型

Tab 5 Genotype of 8 patients with early child nephrotic syndrome

NoGeneMutationsiteCDSProteinsequenceCDSProteinsequence1WT1c.1180C>Tp.R394W--2c.1180C>Tp.R394W--3ISV9+6T>C---4NPHS2c.215G>Tp.G72Vc.466_467insTL156Ffs115c.370A>Gp.C124Rc.413G>Ap.R138Q6INF2c.558C>Tp.S186P--7NPHS1c.349G>Ap.E117Kc.3325C>Tp.R1109X8c.349G>Ap.E117Kc.1339G>Ap.E447K

圖4NPHS1、NPHS2和INF2基因檢測圖

Fig 4 Mutations ofNPHS1,NPHS2 andINF2 genes

Notes A:NPHS2 gene, p.G72V, the panel form left to right was represented patient, and his sister, father and mother respectively; B,C:NPHS1 gene,p.R1109X and p.E447K; D:INF2 gene,Sanger of p.S186P

圖5NPHS1和NPHS2編碼蛋白保守性分析

Fig 5 Conservation analysis of proteins encoding byNPHS1 andNPHS2 genes in multi-species

Notes Upper panel:NPHS1 gene, p.E117K; Lower panel:NPHS2 gene,p.G72V

2.5 兒童遲發(fā)型NS 84例兒童遲發(fā)型NS中，男51例，女33例，平均發(fā)病年齡6.8歲，SRNS 34例(初發(fā)型18例，遲發(fā)型16例)，SSNS 50例(初發(fā)治療敏感12例，非頻復發(fā)10例，頻復發(fā)或激素依賴28例)。初發(fā)型SRNS 18例中，微小病變11例，系膜增生性腎小球腎炎3例，局灶節(jié)段性腎小球硬化2例，局灶增生性腎炎1例，1例未做腎活檢。遲發(fā)型SRNS 16例中，微小病變8例，系膜增生性腎小球腎炎2例，局灶增生性腎炎2例，局灶節(jié)段性腎小球硬化2例，2例未做腎活檢。Sanger測序和SnapShot分析均未發(fā)現(xiàn)致病性突變。

3 討論

1991年，有研究發(fā)現(xiàn)WT1基因突變會累及腎臟，表現(xiàn)為SRNS。1998年，先天性NS芬蘭型致病基因NPHS1的定位克隆，開啟了遺傳性NS基因研究的新時代[22]。之后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)NPHS2、PLCE1等基因與非綜合征型(單純型或孤立型)NS的發(fā)病有關(guān)，而LAMB2、LMX1B、COQ6等基因與綜合征型NS的發(fā)病有關(guān)[4, 23～25]。這些遺傳性NS的共同特征是對激素和免疫抑制劑耐藥，如何將SRNS患兒篩選出來給予個體化的治療，是兒童腎臟科?？漆t(yī)生所面臨的重要問題。本研究發(fā)現(xiàn)先天性、嬰兒型和兒童早發(fā)型NS中的初發(fā)型SRNS存在相關(guān)致病基因的突變；這些患兒應該是臨床基因篩查的主要對象；而SSNS、兒童早發(fā)型NS中的遲發(fā)型SRNS和兒童遲發(fā)型NS未發(fā)現(xiàn)相關(guān)致病基因的突變，因此這些患兒不建議常規(guī)進行基因突變篩查。

先天性NS是指宮內(nèi)或出生3個月以內(nèi)發(fā)病的NS[26]。研究發(fā)現(xiàn)NPHS1、NPHS2、PLCE1、LAMB2、LMX1B、COQ6和WT1基因與先天性NS發(fā)病有關(guān)[2, 12, 26]。在芬蘭、日本等地區(qū)，NPHS1是先天性NS的主要致病基因[27, 28]。雖然國內(nèi)學者報道了NPHS1、LAMB2、WT1基因突變引發(fā)先天性NS的病例，但中國先天性NS的主要致病基因尚不清楚[18～20]。本研究對NPHS1、NPHS2、PLCE1、LAMB2、LMX1B、COQ6和WT1基因進行突變分析，發(fā)現(xiàn)8/10例先天性NS患兒存在NPHS1致病性突變，未發(fā)現(xiàn)NPHS2、PLCE1、LAMB2、LMX1B、COQ6和WT1基因突變。盡管本研究先天性NS病例來自全國各地，但畢竟是單中心研究，還需與國內(nèi)其他中心數(shù)據(jù)進一步證實NPHS1是中國先天性NS患兒的主要致病基因，在先天性NS患兒中推薦首先行NPHS1基因檢測。本文8例先天性NS患兒均攜帶2個致病性雜合突變，未發(fā)現(xiàn)純合突變，其中2個家系NPHS1基因突變分析提示2例患兒的雜合突變均分別來自父母，屬于復合雜合突變。由于NPHS1基因致病的遺傳方式為常染色體隱性遺傳，只有在純合或復合雜合突變情況下致病，推測其他6例也可能復合雜合突變致病。p.R268X、p.C528G、p.Q930X、p.Q1071fsX1142、IVS12+1C>A、p.Q1148fsX1179、IVS26DS-2A>T、p.R711G、p.T517K 和 p.S520L 突變既往未見報道，為新發(fā)現(xiàn)的突變，其中p.C528G、p.Q930X、p.R711G、p.T517K 和 p.S520L錯義突變經(jīng)在線軟件預測均為有害性突變。這些新的致病性突變進一步豐富了NPHS1基因突變譜。

11/12例(91.7%)嬰兒型NS表現(xiàn)對激素初發(fā)耐藥。6例初發(fā)型SRNS患兒檢出NPHS1(1例)、NPHS2(2例)、WT1(3例)基因突變。表3中例12起病年齡為8個月，表現(xiàn)初發(fā)型SRNS，臨床符合遺傳性NS的特點，該患兒存在NPHS1基因p.E117K和 p.R408Q錯義突變。p.R408Q錯義突變經(jīng)在線軟件預測為有害性突變，在不同物種中具有保守性，既往未報道，考慮為新的致病突變。雖然p.E117K在人群的突變頻率較高，為單核苷酸多態(tài)性，但經(jīng)在線軟件預測為有害性突變，在不同物種中也具有保守性，該位點可能位于重要的結(jié)構(gòu)域內(nèi)，推測其在單個雜合時不致病，存在其他致病性突變時就可能致病。2例還檢出NPHS2基因的雙雜合突變，其分別為p.R71X和p.D166G，以及p.R138Q 和p.L156Ffx11，其中p.D166G為新發(fā)現(xiàn)的突變，生物信息學分析為有害性突變。3例存在WT1雜合剪切突變，分別為ISV 9+5G>A、 IVS 8+1G>T 和ISV 8+5G>A，其中ISV 8+5G>A為新發(fā)現(xiàn)的突變，在剪切位點在線軟件預測為有害性突變。本文12例嬰兒型NS均未發(fā)現(xiàn)PLCE1基因突變，結(jié)合10例先天性NS患兒也未檢出PLCE1基因突變，提示PLCE1不是本研究1歲以內(nèi)兒童NS的主要致病基因。本研究1歲以內(nèi)NS 14/20例(70.0%)檢出相關(guān)基因突變，這與國外的報道相似(66.6%)，所涉及的致病基因也與國外相似[12]。因此，1歲以內(nèi)兒童NS主要是由遺傳因素致病，應該在該類人群中行致病基因篩查。

早發(fā)型NS是兒童NS的主要類型，本研究8/132例兒童早發(fā)型NS檢出WT1(3例)、NPHS1(2例)、NPHS2(2例)和INF2(1例)基因突變。3例WT1基因突變分別為p.R394W 和ISV 9 +6T>C，均為已報道的突變[28, 29]。2例存在雙雜合NPHS2基因突變，分別是p.G72V和L156Ffs11、p.C124R和p.R138Q突變。p.C124R和p.G72V是新的突變，p.C124R經(jīng)生物信息學分析為致病性突變，p.G72V經(jīng)生物信息學分析為中性突變，但家系NPHS2基因突變分析提示p.G72V為denovo突變，具有保守性，不排除p.G72V有致病可能，其功能需要進一步實驗證實。3例NPHS1基因突變通過SnapShot分析發(fā)現(xiàn)，其分別攜帶p.R1109X、p.E447K和p.S186P雜合突變，經(jīng)Sanger法驗證；2例NPHS1基因突變除了分別發(fā)現(xiàn)p.R1109X和p.E447K突變外，還發(fā)現(xiàn)p.E117K突變。提示SnapShot技術(shù)不適合無熱點突變的基因分析，容易遺漏其他致病位點，尤其是未報道的突變位點。1例INF2基因p.S186P突變也是通過SnapShot分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Sanger法證實，該突變位點為已報道的致病性突變[30]。INF2基因的遺傳方式為常染色體顯性遺傳，發(fā)病年齡較遲[21]，但本文檢出的患兒發(fā)病年齡較小。8例(25.0%)檢出基因突變的兒童早發(fā)型NS均表現(xiàn)初發(fā)型SRNS，19例遲發(fā)型SRNS和81例SSNS患兒均未檢出相關(guān)基因突變，提示臨床應該關(guān)注初發(fā)型SRNS患兒，在選擇免疫抑制劑治療前應行NPHS1、NPHS2和WT1基因的檢測。

本研究對84例遲發(fā)型NS患兒行NPHS2和WT1基因測序，以及NPHS1等8個基因42個突變位點SnapShot分析，無論初發(fā)型SRNS、遲發(fā)型SRNS，抑或SSNS均未發(fā)現(xiàn)上述基因突變，提示遲發(fā)型NS由遺傳因素致病的概率不高，可能是其他因素致病，如免疫紊亂等。不推薦對遲發(fā)型NS患兒常規(guī)進行基因篩查。

本研究的不足之處和局限性：未對其他致病基因進行外顯子測序，不排除其他基因致病可能。

[1]Li GM(李國民)，Gao XW，Xu H，et al. Clinical characteristics and INF2 gene mutation analysis in a family with autosomal dominant focal segmental glomerulosclerosis. Chin J Evid Based Pediatr(中國循證兒科雜志),2013,8(3):192-196

[2]Li GM(李國民)，Shen Q，Xu H，et al. 兒童激素耐藥腎病綜合征相關(guān)致病基因及其臨床檢測策略. Chin J Evid Based Pediatr(中國循證兒科雜志),2013,8(5):391-397

[3]Gupta IR, Baldwin C, Auguste D, et al. ARHGDIA: a novel gene implicated in nephrotic syndrome. J Med Genet,2013,50(5):330-338

[4]Sadowski CE, Lovric S, Ashraf S, et al. A single-gene cause in 29.5% of cases of steroid-resistant nephrotic syndrome. J Am Soc Nephrol,2015,26(6):1279-1289

[5]Lipska BS, Iatropoulos P, Maranta R, et al. Genetic screening in adolescents with steroid-resistant nephrotic syndrome. Kidney Int,2013,84(1):206-213

[6]Swierczewska M, Ostalska-Nowicka D, Kempisty B, et al. Molecular basis of mechanisms of steroid resistance in children with nephrotic syndrome. Acta Biochim Pol,2013,60(3):339-344

[7]Chiang CK, Inagi R. Glomerular diseases: genetic causes and future therapeutics. Nat Rev Nephrol,2010,6(9):539-554

[8]Santin S, Bullich G, Tazon-Vega B, et al. Clinical utility of genetic testing in children and adults with steroid-resistant nephrotic syndrome. Clin J Am Soc Nephrol,2011,6(5):1139-1148

[9]Joshi S, Andersen R, Jespersen B, et al. Genetics of steroid-resistant nephrotic syndrome: a review of mutation spectrum and suggested approach for genetic testing. Acta Paediatr,2013,102(9):844-856

[10]Fletcher J, Mcdonald S, Alexander SI. Prevalence of genetic renal disease in children. Pediatr Nephrol,2013,28(2):251-256

[11]Rood IM, Deegens JK, Wetzels JF. Genetic causes of focal segmental glomerulosclerosis: implications for clinical practise. Nephrol Dial Transplant,2012，27(3):882-890

[12]Hinkes BG, Mucha B, Vlangos CN, et al. Nephrotic syndrome in the first year of life: two thirds of cases are caused by mutations in 4 genes (NPHS1, NPHS2, WT1, and LAMB2). Pediatrics,2007,119(4):e907-e919

[13]中華醫(yī)學會兒科學分會腎臟病學組. Clinical classification,diagnosis and treatment of glomerular diseases in children. Chin J Pediatr(中華兒科雜志),2001,39(12):476-477

[14]Lombel RM, Gipson DS, Hodson EM. Treatment of steroid-sensitive nephrotic syndrome: new guidelines from KDIGO. Pediatr Nephrol,2013,28(3):415-426

[15]van Husen M, Kemper MJ. New therapies in steroid-sensitive and steroid-resistant idiopathic nephrotic syndrome. Pediatr Nephrol,2011,26(6):881-892

[16]Li GM(李國民)，Xu H, Gao XW, et al. Causes analysis of 36 children with focal segmental glomerulosclerosis. Chin J Obstet Gynecol Pediatr (Electron Ed)[中華婦幼臨床醫(yī)學雜志(電子版)],2013,9(3):323-329

[17]Lenkkeri U, Mannikko M, Mccready P, et al. Structure of the gene for congenital nephrotic syndrome of the finnish type (NPHS1) and characterization of mutations. Am J Hum Genet,1999,64(1):51-61

[18]Wu LQ, Hu JJ, Xue JJ, et al. Two novel NPHS1 mutations in a Chinese family with congenital nephrotic syndrome. Genet Mol Res,2011,10(4):2517-2522

[19]Zhao D, Ding J, Wang F, et al. The first Chinese Pierson syndrome with novel mutations in LAMB2. Nephrol Dial Transplant,2010,25(3):776-778

[20]Li J, Ding J, Zhao D, et al. WT1 gene mutations in Chinese children with early onset nephrotic syndrome. Pediatr Res,2010,68(2):155-158

[21]Barua M, Brown EJ, Charoonratana VT, et al. Mutations in the INF2 gene account for a significant proportion of familial but not sporadic focal and segmental glomerulosclerosis. Kidney Int,2013,83(2):316-322

[22]Kestila M, Lenkkeri U, Mannikko M, et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome. Mol Cell,1998,1(4):575-582

[23]Boute N, Gribouval O, Roselli S, et al. NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome. Nat Genet,2000,24(4):349-354

[24]Gbadegesin R, Bartkowiak B, Lavin PJ, et al. Exclusion of homozygous PLCE1 (NPHS3) mutations in 69 families with idiopathic and hereditary FSGS. Pediatr Nephrol,2009,24(2):281-285

[25]Heeringa SF, Chernin G, Chaki M, et al. COQ6 mutations in human patients produce nephrotic syndrome with sensorineural deafness. J Clin Invest,2011,121(5):2013-2024

[26]Jalanko, H.Congenital nephrotic syndrome. Pediatr Nephrol, 2009, 24(11), 2121-2128

[27]Sako M, Nakanishi K, Obana M, et al. Analysis of NPHS1, NPHS2, ACTN4, and WT1 in Japanese patients with congenital nephrotic syndrome. Kidney Int,2005,67(4):1248-1255

[28]Lehnhardt A, Karnatz C, Ahlenstiel-Grunow T, et al. Clinical and molecular characterization of patients with heterozygous mutations in wilms tumor suppressor gene 1. Clin J Am Soc Nephrol,2015,10(5):825-831

[29]Pelletier J, Bruening W, Kashtan CE, et al. Germline mutations in the Wilms' tumor suppressor gene are associated with abnormal urogenital development in Denys-Drash syndrome. Cell,1991,67(2):437-447

[30]Sanchez-Ares M, Garcia-Vidal M, Antucho EE, et al. A novel mutation, outside of the candidate region for diagnosis, in the inverted formin 2 gene can cause focal segmental glomerulosclerosis. Kidney Int,2013,83(1):153-159

(本文編輯：張崇凡)

Studies on strategy of gene screening in children with nephrotic syndrome

LIGuo-min1,4,SHENQian1,4,XUHong1,FANGXiao-yan1,ZHAIYi-hui1,SUNLi1,LIUHai-mei1,RAOJia1,CHENJing1,WUBing-bing2,GAOXue-wu3,ANYu3

(1DepartmentofNephrology,Children'sHospitalofFudanUniversity,Shanghai201102; 2MedicalTranslationalCenterofChildren'sHospitalofFudanUniversity,Shanghai201102; 3InstitutesofBiomedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200023,China; 4Hasequalcontribution)

XU Hong，E-mail:hxu@shmu.edu.cn

ObjectiveTo explore causative genes of nephrotic syndrome(NS) in children and its mutant characteristics.MethodsAll NS children in Children's Hospital of Fudan University from Jan. 1st, 2011 to Dec. 31th, 2013 were enrolled. The clinical data including medical records and follow-up information, and peripheral blood were collected. Firstly, NS was classified into familial and sporadic NS according to family history. Then sporadic NS was divided into congenital NS (CNS), infantile NS, early-child NS and late-child NS in accordance with the age of onset. Early- and late-child NS were divided into steroid-sensitive NS (SSNS) and steroid-resistant NS (SRNS) on the basis of initial sensitivity to glucocorticoid, and then SRNS was divided into initial- and late-resistant SRNS.NPHS1,NPHS2,PLCE1,LAMB2,LMX1B,COQ2 andWT1 genes were tested in patients with CNS by direct sequencing, whileNPHS1,NPHS2,PLCE1 andWT1 were tested in patients with infantile NS. To early- and late-child NS,NPHS2 andWT1 were tested by direct sequencing, 42 common gene mutations in 8 main genes, likeNPHS1 was tested by SnapShot analysis.ResultsCausative mutations inNPHS1 was found in 8 cases (80%), none mutations inNPHS2,PLCE1,LAMB2,LMX1B,COQ2, orWT1 gene was found in 10 CNS cases. 6 out of 12 cases with infantile NS had mutations, 3 of which was inWT1 gene, 2 inNPHS2 gene, and 1 inNPHS1 gene. In 132 cases of early-onset NS children, 8 cases (6.1%) with initial SRNS had gene mutations.WT1 gene mutation was found in 3 cases (3/32, 9.4).NPHS2 mutations were detected in 2 patients (2/32, 6.3%).NPHS1 mutations were identified in 2 patients (2/32, 6.3%).INF2 mutation was found in one case. No mutations were found in early-child NS children with late SRNS or SSNS. There were no causative mutations of tested genes detected among 84 cases of late-child NS children.ConclusionCandidate gene screening should be performed in congenital and infantile NS as well as in early-child NS children with initial SRNS. High frequency of mutations inNPHS1,NPHS2 andWT1 was found in children with infantile NS and early-child NS children with initial SRNS.NPHS1 is a common causative gene in this study. Mutational analysis is suggested in children with congenital NS. Routine gene screening is not suggested in children with late SRNS and SSNS.

Children; Nephrotic syndrome; Causative gene; SnapShot analysis; Direct sequencing

10.3969/j.issn.1673-5501.2015.05.006

復旦大學附屬兒科醫(yī)院人才工程-學科帶頭人(1125)培育計劃

1 復旦大學附屬兒科醫(yī)院腎臟風濕科 上海，201102；2 復旦大學附屬兒科醫(yī)院醫(yī)學轉(zhuǎn)化中心 上海，201102；3 復旦大學生物醫(yī)學研究院 上海，200023；4共同第一作者

徐虹，E-mail:hxu@shmu.edu.cn

2015-04-30

2015-09-27)