高效液相色譜法測定藤茶中二氫楊梅素和楊梅素含量

陳圖鋒，高文華*，唐 敏

(1.汕頭大學(xué) 分析測試中心，廣東 汕頭 515063；2.汕頭大學(xué) 化學(xué)系，廣東 汕頭 515063)

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高效液相色譜法測定藤茶中二氫楊梅素和楊梅素含量

陳圖鋒1,2，高文華1,2*，唐 敏2

(1.汕頭大學(xué) 分析測試中心，廣東 汕頭 515063；2.汕頭大學(xué) 化學(xué)系，廣東 汕頭 515063)

目的：建立以高效液相色譜法同時測定藤茶中二氫楊梅素和楊梅素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為SUPELCO Discovery C18HPLC Column (25cm×4.6mm,5μm)；流動相為甲醇-0.03%磷酸溶液，采用梯度洗脫，流速為0.8mL·min-1，楊梅素和二氫楊梅素檢測波長分別為373nm和290nm。結(jié)果：藤茶中二氫楊梅素和楊梅素分別在0.15～94.0mg·L-1(R2=1)和0.62～77.50mg · L-1(R2=0.999 7)濃度范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系；平均加標(biāo)回收率分別為89.7%、93.5%，RSD<4.5%。結(jié)論：該法簡便、快速、準(zhǔn)確，可用于藤茶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究及其質(zhì)量控制。

藤茶；二氫楊梅素；楊梅素；高效液相色譜法；含量測定

藤茶(Ampelopsisgrossedentata)又名山甜茶、眉茶、白茶、龍須茶、溪黃草等，屬于葡萄科蛇葡萄屬中的顯齒蛇葡萄，是一種野生藤本植物[1]。研究表明，黃酮類化合物是藤茶的主要活性成分[2-3]，含量高達(dá)38%以上，其中二氫楊梅素與楊梅素含量最高[4]。二氫楊梅素具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗腫瘤、降低血脂和血糖水平，提高SOD活性等特殊功效[5]。楊梅素具有抗腫瘤、降低神經(jīng)毒性、降血糖、保肝護(hù)肝、抗突變、預(yù)防齲齒等多種藥理活性[6-7]。

目前文獻(xiàn)報道對于藤茶的質(zhì)量監(jiān)控僅以測定二氫楊梅素含量為主，主要有HPLC[8]和紫外-可見分光光度法[9]。紫外-可見分光光度法適于大類成分的含量測定，如總黃酮、總蒽醌、總生物堿等。本試驗采用HPLC-DAD雙波長同時檢測二氫楊梅素和楊梅素含量，以期為藤茶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀，G1315B DAD檢測器，ChemStation for LC 3D Rev.A.10.01[1635]工作站，METTLER TOLEDO AL204電子天平，Millipore Milli-Q50 純水器，上海科導(dǎo)超聲儀器SK2200HP超聲波水浴，上海大普儀器PHS-3CA型精密酸度計。

1.2 試劑

甲醇(TEDIA)；乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；丙酮(廣東西隴化工)；石油醚(30～60℃)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙酸(廣州試劑三廠)；磷酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；藤茶樣品(恩施綠神(中港合資)生物制品有限公司)；楊梅素對照品(阿拉丁，批號：21487)；二氫楊梅素對照品(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥物研究所)；甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純。

1.3 色譜條件

色譜柱：SUPELCO Discovery C18HPLC Column (25cm×4.6mm,5μm)；流動相：甲醇-0.03%磷酸，梯度洗脫(0min，甲醇-0.03%磷酸比例為12∶88，25min比例為65∶35；30～40min，比例為12∶88)；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：35 ℃；波長：二氫楊梅素(290nm)、楊梅素(373nm)；進(jìn)樣量：5μL。在上述色譜條件下進(jìn)行測定，二氫楊梅素和楊梅素的色譜見圖1。

圖1 二氫楊梅素、楊梅素對照品色譜

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取楊梅素1.55mg，二氫楊梅素1.88mg，分別置于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，楊梅素標(biāo)準(zhǔn)母液濃度為155mg· L-1，二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)母液濃度為188mg·L-1，待用。

分別量取上述配制好的楊梅素標(biāo)準(zhǔn)母液和二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)母液各5mL，置于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度。得楊梅素77.5mg· L-1、二氫楊梅素94mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)母液，待用。

1.5 樣品處理

1.5.1 楊梅素待測液 取樣品藤茶，精確稱量0.500g，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。超聲提取30min，過0.45μm的濾膜過濾，此為楊梅素待測液。

1.5.2 二氫楊梅素待測液 取0.5mL“1.5.1”項中制備的楊梅素待測液于50mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，過0.45μm的濾膜過濾，此為二氫楊梅素待測液(由于藤茶中二氫楊梅素含量較高，所以需要稀釋)。藤茶樣品色譜見圖2。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理條件的選擇

稱取0.5g的藤茶樣品，置于10mL容量瓶中，分別比較了甲醇、乙醇、石油醚、丙酮等提取溶劑，結(jié)果表明，以甲醇作為提取溶劑，超聲提取時間為30min，可獲得良好的提取效果。

2.2 色譜條件的優(yōu)化和選擇

2.2.1 最適波長選擇 對二氫楊梅素峰和楊梅素峰在200～400nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果表明二氫楊梅素在205nm和290nm 處吸收值高，而楊梅素在208nm和373nm 處吸收值高，考慮到在205nm和208nm處樣品的干擾較大，因此選擇290nm作為二氫楊梅素的檢測波長，373nm作為楊梅素的檢測波長。

圖2 藤茶樣品色譜

2.2.2 流動相的選擇 楊梅素和二氫楊梅素在不同pH值下具有不同的穩(wěn)定性[10-11]，當(dāng)pH≥9.0時二氫楊梅素會因處于堿性環(huán)境而發(fā)生自動氧化作用,生成了其它成分；楊梅素在堿性條件下穩(wěn)定性極差。所以本實驗選用乙酸-甲醇和磷酸-甲醇作為流動相，并對pH=2.0、2.5、3.3、4.4、5.5、6.4時的譜圖進(jìn)行比較。結(jié)果表明采用甲醇-0.03%磷酸，0.03%磷酸pH值為2.5較好。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

根據(jù)“1.4”項中配制好的混合標(biāo)準(zhǔn)母液濃度，逐級稀釋配制成楊梅素、二氫楊梅素濃度為(77.5mg· L-1，94.0mg·L-1) (15.5mg·L-1，18.8mg·L-1)，(3.1mg·L-1，3.76mg·L-1)，(0.62mg·L-1，0.752mg·L-1)，(0.124mg·L-1，0.150 4mg·L-1)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次從低濃度到高濃度，按“1.3”項色譜條件進(jìn)行測定，每一濃度連續(xù)測定3次，以峰面積平均值Y為縱坐標(biāo)，濃度X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得楊梅素回歸方程：Y=14.104X -10.055(R2=0.999 7)，二氫楊梅素回歸方程：Y=15.27X +0.991 4(R2=1)，表明楊梅素在0.62～77.50mg·L-1、二氫楊梅素在0.15～94.00mg·L-1范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

2.4 最低檢出限

2.4.1 楊梅素最低檢出限 取楊梅素濃度為0.62mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液3mL于5mL容量瓶中，按“1.3”項中色譜條件進(jìn)行測定，測得信噪比為3時，楊梅素最低檢出限為20mg·kg-1。

2.4.2 二氫楊梅素最低檢出限 取二氫楊梅素濃度為0.15mg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.3”項中色譜條件進(jìn)行測定，測得信噪比為3時，二氫楊梅素的最低檢出限為240mg· kg-1。

2.5 回收率試驗

向空白樣品中加入3種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照前述處理方法進(jìn)行實驗，每個水平重復(fù)測定3次，得到其回收率，見表 1。

表1 加標(biāo)回收率測定結(jié)果

實驗表明，高、中、低濃度的加標(biāo)回收率均在88.00%以上，RSD<4.5%，符合要求。

2.6 精密度試驗

取“2.3”項中楊梅素、二氫楊梅素分別為(15.5mg·L-1，18.8mg·L-1)的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液進(jìn)行精密度檢測，按照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣10次，測得峰面積。分別得到楊梅素和二氫楊梅素的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.93%、1.17%，符合要求。

2.7 藤茶中楊梅素和二氫楊梅素含量的測定

采用本方法對藤茶樣品進(jìn)行檢測，最終測得楊梅素含量為6.73mg·g-1，二氫楊梅素含量為135.2mg·g-1。

3 結(jié)論

藤茶中楊梅素和二氫楊梅素分別在0.62～77.50mg·L-1和0.15～94.00mg·L-1濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系；平均加樣回收率分別為93.5%、89.7%，RSD<4.5%。結(jié)果表明該方法操作簡便、快速、準(zhǔn)確，可為藤茶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

[1] 中國科學(xué)院植物研究所.中國高等植物圖鑒補(bǔ)編(第二冊)[M].北京:科學(xué)出版社,1979:353.

[2] 李剛,鄭作文.藤茶總黃酮含藥血清對2215細(xì)胞分泌乙肝病毒HBsAg和HBeAg的影響研究[J].中國藥房,2008,19(18)：1366.

[3] 李剛,鄭作文,唐云麗.藤茶總黃酮體外抗人肝癌細(xì)胞作用研究[J].中國藥房,2008,19(9)：652.

[4] 覃沽萍,許學(xué)鍵,李劍江.廣西瑤族藤茶化學(xué)成分的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),1997,9(4)：41.

[5] 楊學(xué)敏,陳立峰.二氫楊梅素的生物活性研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥報,2008,14(12):86-89.

[6] 張秀娟,黃清玲,季宇彬.楊梅素的藥理活性研究進(jìn)展[J].天津藥學(xué),2008,20(5):57-60.

[7] 臧寶霞,金鳴,吳偉，等.楊梅素對血小板活化因子拮抗的作用[J].藥學(xué)學(xué)報,2003,38(11):831-833.

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[9] 陳績光,王玫馨,蔡沛祥,等.無刺根中蛇葡萄素和楊梅素的含量測定[J].中藥材,1997,20(1):23-24.

[10] 何桂霞,裴剛,李斌，等.二氫楊梅素的穩(wěn)定性研究[J].中國新藥雜志,2007,16(22):1888-1890.

[11] 王志江.楊梅素的穩(wěn)定性研究[J].廣東微量元素科學(xué),2008,15(10):37-40.

(責(zé)任編輯：宋勇剛)

Content Determination of Dihydromyricetin and Myricetin in Leaves ofAmpelopsisGrossedentataby HPLC

Chen Tufeng1,Gao Wenhua1，2*，Tang Min2

(1.Analysis & Testing Center,Shantou University,Guangdong 515063, China； 2.Department of Chemistry, Shantou University, Guangdong 515063, China )

Objective:To develop a method for the content determination of dihydromyricetin(DMY) and myricetin(MY)in leaves ofAmpelopsisgrossedentata.Methods:HPLC method was adopted.The separation was performed on SUPELCO Discovery C18 (25cm×4.6mm,5μm)column with 0.03% phorsphoric acid-methanol as mobile phase at flow rate of 0.8 mL·min-1.The detection wavelength of MY was set at 373 nm，and that of DMY was set at 290 nm. Results:The linear range was 0.15～94mg·L-1(R2=1)for DMY and 0.62～77.50mg·L-1(R2=0.999 7) for MY with average recovery of 89.7% and 93.5%,RSD<4.5%. Conclusion:The method is simple,fast,accurate aprovide the basis for the quality standard of leaves ofA.grossedentata.

Leaves ofAmpelopsisgrossedentata；Dihydromyricetin；Myricetin；HPLC；Content Determination

2014-08-20

廣東省自然科學(xué)基金資助項目(S2011010005208);廣東省教育廳科技創(chuàng)新項目(2013KJCX0078)

陳圖鋒(1978-)，男，廣東省汕頭大學(xué)分析測試中心助理工程師，研究方向為分析化學(xué)。

高文華(1968-)，男，博士，廣東省汕頭大學(xué)教授，研究方向為分析化學(xué)。E-mail: whgao@stu.edu.cn

R284.1

A

1673-2197(2015)01-0028-02

10.11954/ytctyy.201501014