卵黃抗體對艱難梭菌感染的治療潛力

常規(guī)抗生素會改變正常腸道菌群的數(shù)量和復(fù)雜性，進(jìn)而會降低這些具有保護(hù)作用的微生物在胃腸道內(nèi)的競爭性定植的能力。因此，容易導(dǎo)致艱難梭菌感染（Clostridium Difficile Infection，CDI）。一旦在結(jié)腸中定植，艱難梭菌會產(chǎn)生毒素A（Clostridium difficile Toxin A，TcdA）和毒素B（Clostridium difficile Toxin B，TcdB），引起包括腹瀉、偽膜性結(jié)腸炎、中毒性巨結(jié)腸及可能致命的多系統(tǒng)器官衰竭等臨床癥狀。

治療CDI公認(rèn)的方法是使用對艱難梭菌敏感的抗生素。在大約80 %的病例中，這種治療方法會完全康復(fù)，而在剩余病例中，會發(fā)生遷延性CDI（rCDI），這是因?yàn)橥Ｓ眉紫踹蚩股睾笪茨苤亟ㄕＮ改c道菌群，導(dǎo)致對艱難梭菌敏感人群復(fù)發(fā)或再發(fā)生CDI。

雖然對TcdA和TcdB在CDI發(fā)病機(jī)制中的作用了解較多，但對其在艱難梭菌腸道定植中的作用了解甚少。不過，有跡象表明，艱難梭菌的確在哺乳動物胃腸道中定植。比如定植艱難梭菌的無癥狀患者表現(xiàn)出發(fā)生CDI風(fēng)險(xiǎn)下降，以克林霉素治療的倉鼠預(yù)定植不產(chǎn)毒艱難梭菌可保護(hù)動物不受隨后野生型產(chǎn)毒菌株感染的影響。此外，CDI患者恢復(fù)期血清含有艱難梭菌細(xì)胞壁相關(guān)成分的抗體（如FliC、FliD、Fbp68、SlpA、Cwp66和Cwp84），在體外研究中發(fā)現(xiàn)這些成分與微生物定植有關(guān)。

本研究使用了三種公認(rèn)的艱難梭菌定植因子（CFs）特異性卵黃抗體（IgY）和候選疫苗，即鞭毛的結(jié)構(gòu)蛋白（鞭毛蛋白）FliC、鞭毛帽蛋白FliD及84 kDa細(xì)胞壁相關(guān)半胱氨酸蛋白酶Cwp84（參與表面層蛋白SlpA的正確加工和組裝）。有充分證據(jù)表明，在通過多種哺乳動物的胃腸道后，純化的IgG及IgY抗體仍保持其抑菌活性。CF-特異性IgY制劑可促進(jìn)CDI患者清除腸道中的艱難梭菌，同時保護(hù)正常胃腸道菌群，降低rCDI的發(fā)病率。

1 方法

1.1 艱難梭菌菌株及培養(yǎng)方法

艱難梭菌630菌株承蒙韋爾科姆基金會桑格研究所的Trevor Lawley博士提供。艱難梭菌VPI 10463（ATCC 43255）菌株從美國典型菌種保藏中心獲得。艱難梭菌菌株常規(guī)培養(yǎng)在源于冷凍原液的Y瓊脂平板培養(yǎng)基中[腦心浸液（BHI）瓊脂，含5 %綿羊血、5 mg血紅素和1 mg的維生素K1]，并在Bactron III型厭氧培養(yǎng)箱中37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。在黏附試驗(yàn)中，將單個菌落接種于BHI培養(yǎng)基，并在37 ℃下厭氧培養(yǎng)18 h，直至培養(yǎng)物達(dá)到指數(shù)生長后期。

用于驗(yàn)證泳動瓊脂分析的艱難梭菌630 fliC基因阻斷突變株（Cdi-fliC-260a）按照Heap等介紹的方法在實(shí)驗(yàn)室利用基于ClosTron組II型內(nèi)含子突變系統(tǒng)構(gòu)建。Western免疫印跡分析、透射電鏡和瓊脂管泳動分析表明，這種fliC基因阻斷突變株缺乏生成鞭毛蛋白（FliC）以及組裝功能性鞭毛絲狀體的能力。

1.2 人體腸道T84細(xì)胞培養(yǎng)物狀況

T84細(xì)胞在5 % CO2、37 ℃的24孔組織培養(yǎng)平板中培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為添加10 %胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。

1.3 克隆FliC、FliD和Cwp84抗原

FliC、FliD和Cwp84基因是由卡爾加里大學(xué)醫(yī)學(xué)院托馬斯·路易博士提供的艱難梭菌卡PCR擴(kuò)增而得。按照文獻(xiàn)所述設(shè)計(jì)PCR引物，然后按廠家說明將PCR產(chǎn)物克隆到pQE-30 UA。用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)轉(zhuǎn)化方法將克隆產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌M15細(xì)胞。按照廠家對pQE-30克隆系統(tǒng)的說明進(jìn)行6xHis-標(biāo)記蛋白的表達(dá)和純化。采用SDS-PAGE（12.5 %分離膠）分析純化蛋白（圖1），通過對凝膠蛋白質(zhì)條帶所獲胰蛋白酶肽的質(zhì)譜分析確認(rèn)其成分。

1.4 雞的免疫方案

抗原制劑（0.1 mg Ni-親和純化6xHis-標(biāo)記重組抗原/0.5 mL PBS，pH 7.2）在弗氏完全佐劑（1∶1）中乳化，肌內(nèi)注射給5月齡白來航胸肌。首次注射兩周后，相同劑量相同方式強(qiáng)化注射，2周后再次重復(fù)。第二和第三次注射以弗氏不完全佐劑代替完全佐劑。最后一次注射后一周集蛋，處理前2 ℃～4 ℃下儲存。

1.5 從凍干蛋黃粉中提純CF-特異性IgY

將2 g凍干蛋黃粉溶于150 mL冰冷蒸餾水中，使用Waring混合機(jī)高速均質(zhì)1 min，然后將pH調(diào)至5.0。2 800轉(zhuǎn)下離心40 min，調(diào)節(jié)上清液pH至4.0，加入活性炭至終濃度0.01 %（w/v）。以2 800轉(zhuǎn)的速度再次離心30 min，所得上清液以Wahtman1號濾紙過濾。濾過液用Amicon超濾杯以100 kDa的超濾膜濃縮至30 mL。濃縮的IgY溶液pH調(diào)節(jié)至9.0，加入40 %硫酸銨4 ℃下沉淀蛋白質(zhì)1 h。然后以3 000轉(zhuǎn)離心溶液30 min。獲得的硫酸銨沉淀溶解在15 mL 0.01M Tris/HCl中（pH 8.0），再次以40 %硫酸銨4 ℃下沉淀IgY 1 h。最后3 000轉(zhuǎn)離心30 min，沉淀物溶解于鈉/鉀 PBS（pH 7.2）中，使用50 kDa超濾透析膜透析過夜。

1.6 SDS-PAGE和Western免疫印跡

重組6x His-標(biāo)記FliC、FliD和Cwp84從大腸桿菌Ni-親和純化，并使用12.5 %的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE分析。分離出的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，200 V下電泳45 min。用5 %脫脂奶Tris緩沖液（TBSTM，含0.05 %Tween20，pH 7.4）封閉。初級IgY抗體稀釋在TBSTM中，并在膜下孵育1 h。然后與結(jié)合辣根過氧化物酶的羊抗-IgY二抗以1∶10 000稀釋添加到TBSTM，并與膜一起孵育1 h。以TBST（不含5 %脫脂奶的TBSTM）充分洗膜后，按照供應(yīng)商的說明以持久性化學(xué)發(fā)光底物檢測試劑盒進(jìn)行免疫反應(yīng)性蛋白成像。

1.7 艱難梭菌泳動檢測

泳動瓊脂試管中含有終濃度為0.175 %的瓊脂BHI溶液。添加IgY抗體至終濃度為10 mg/mL。過夜培養(yǎng)物中獲得的艱難梭菌630菌株和Flic基因阻斷突變菌株垂直注入瓊脂。然后將試管在37 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h。

1.8 倉鼠保護(hù)實(shí)驗(yàn)

體重80 g～100 g的雄性敘利亞倉鼠（Harlan實(shí)驗(yàn)室）在試驗(yàn)前5 d以溶解于PBS的克林霉素磷酸酯灌胃處理，劑量為30 mg/kg體重。5 d后（試驗(yàn)第0天），倉鼠灌胃接受懸浮于DMEM/F12的103艱難梭菌菌630株孢子。以未免疫雞卵黃處理的倉鼠在試驗(yàn)第0天以及此后每隔10 d接受懸浮于0.5 mL 0.1 M碳酸鹽緩沖液（pH 9.0）的45 mg凍干粉。僅以純化FliD-特異性IgY處理的倉鼠每天接受溶于0.5 mL碳酸氫鹽緩沖液中的0.5 mg蛋白（使用二辛可寧酸測定法測定），為期10 d。以來源于未免疫雞卵黃的純化重組FliD-特異性IgY處理的動物每天接受相同量的FliD-特異性IgY（0.5 mg蛋白）+溶解于0.5 mL碳酸氫鹽緩沖液中的45 mg凍干蛋黃粉，為期10 d。每4 h檢查倉鼠，出現(xiàn)CDI癥狀時（肛周染色、反應(yīng)遲鈍）馬上CO2處死。

1.9 免疫標(biāo)記程序

單一的艱難梭菌630菌落在2 %甲醛/0.5 %戊二醛的50 mM二甲胂酸鈉緩沖液（pH 7.4）中厭氧懸浮20 min。然后將10 μL的固定化細(xì)菌添加到活性炭涂布的透射電鏡格柵2 min，過量溶液用濾紙輕輕吸去。將格柵樣品面向下浮于50 μL 5 % BSA的PBS溶液1 h，進(jìn)行封閉。然后將格柵轉(zhuǎn)移至50 μL 1∶50稀釋的FliD-特異性IgY溶液或稀釋在5 %BSA中的對照IgY溶液1 h。以PBS徹底洗滌后，將格柵轉(zhuǎn)移至50 mL 1∶25稀釋、結(jié)合有15 nm金粒的羊抗-IgY 1 h。以PBS洗滌后，添加10 mL的1 %磷鎢酸進(jìn)行格柵染色（pH 7.0）10 s。用濾紙輕輕吸去過量染色液，并使用日立H-7650透射電鏡檢查干燥格柵。

1.10 T84細(xì)胞艱難梭菌黏附試驗(yàn)

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。生長后期指數(shù)階段（OD600=0.65）的艱難梭菌VPI 10463培養(yǎng)物稀釋于過夜預(yù)還原的DMEM/F12[含CF-特異性或?qū)φ章腰SIgY制劑（1 mg/mL）]，并添加到濃度大約為106 cfu/mL（m.o.i.=1∶1）T84細(xì)胞單層中。組織培養(yǎng)平板在37 ℃下厭氧孵育3 h，然后以無菌PBS洗滌5次，以除去非貼壁細(xì)菌。在3 h的厭氧培養(yǎng)后使用MTT細(xì)胞殖測定法測定T84細(xì)胞的活力。為測定黏附細(xì)菌數(shù)量，以含有1 mM EDTA的0.25 %胰蛋白酶處理T84細(xì)胞，然后在無菌PBS中稀釋10倍。隨后將稀釋液分三份接種于Y瓊脂平板上。將平板在37 ℃下厭氧培養(yǎng)48 h，所得菌落稀釋至30～300個菌落/平板后計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

圖1為SDS-PAGE凝膠圖像，對用于免疫雞的Ni-親和純化重組艱難梭菌FliC、FliD和Cwp84抗原進(jìn)行分析。箭頭所指條帶從凝膠中切除，并用于質(zhì)譜分析中3種純化蛋白鑒別。

根據(jù)厭氧條件下抑制艱難梭菌VPI10463菌株黏附結(jié)腸T84細(xì)胞單層的能力，對重組艱難梭菌FliC、FliD或Cwp84免疫的雞所產(chǎn)卵黃進(jìn)行初步篩選。試驗(yàn)結(jié)果（圖2）表明，含F(xiàn)liD-特異性IgY的卵黃抑制艱難梭菌對T84細(xì)胞單層黏附效果明顯優(yōu)于其他未免疫雞所產(chǎn)卵黃（P<0.001）或有FliC-特異性IgY的卵黃（P<0.05）。雖然以1∶1∶1比例混合的三種CF-特異性卵黃制劑混合物抑制艱難梭菌黏附T84細(xì)胞的效果顯著優(yōu)于（P<0.05）FliC-特異性卵黃，不過3種制劑的混合并未優(yōu)于FliD-特異性制劑的抑制效果。因此，選擇含有FliD特異性-IgY的卵黃作進(jìn)一步評估。

采用此前Ko和Ahn報(bào)道的兩步活性炭脫脂硫酸銨沉淀法由凍干卵黃純化獲得FliD特異性-IgY。SDS-PAGE分析（圖3a）表明使用這種簡單有效的方法純化IgY主要形成分子量為68 kDa和30 kDa的蛋白質(zhì)特征條帶，分別為IgY的重鏈和輕鏈。圖3（b）的結(jié)果表明，在免疫印跡中與FliD抗原結(jié)合的純化FliD-特異性IgY制劑與FliC或Cwp84抗原沒有交叉反應(yīng)。此外，抗原捕獲型ELISA結(jié)果表明，與FliD-特異性卵黃粗制劑相比，凍干蛋黃純化FliD-特異性IgY可顯著提高其滴度（圖4）。此外，瓊脂泳動分析表明，與含對照IgY或不含IgY的瓊脂泳動相比，F(xiàn)liD-特異性IgY制劑可降低艱難梭菌630菌株的活動性（圖6）。

五項(xiàng)獨(dú)立倉鼠CDI保護(hù)試驗(yàn)得到的累計(jì)存活結(jié)果如圖7所示。數(shù)據(jù)表明，與接受未免疫雞卵黃相比，單獨(dú)使用純化FliD-特異性IgY碳酸鹽緩沖液可顯著提高（P<0.05。雙尾Fisher精確檢驗(yàn)）倉鼠感染濃度為103的艱難梭菌630菌株孢子的存活率。此外，含對照卵黃的重組純化FliD-特異性IgY未顯著改變其在倉鼠CDI試驗(yàn)中的保護(hù)效力。

3 討論

我們希望檢驗(yàn)這樣一個假設(shè)，即針對艱難梭菌毒力因子的治療方式可能是一種更為有效的CDI治療或輔助治療措施。此前有證據(jù)表明FliD黏附于鼠盲腸黏液制劑，這表明這種鞭毛成分不僅具有調(diào)節(jié)鞭毛組裝作用及運(yùn)動功能外，還是艱難梭菌的黏附素。另一項(xiàng)研究表明，CDI感染者生成艱難梭菌FliD、FliC、一種纖連蛋白結(jié)合蛋白Fpb68和Cwp66的血清抗體，且對艱難梭菌FliD比對FliC產(chǎn)生更為強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。

本文給出的結(jié)果確認(rèn)了艱難梭菌FliD鞭毛帽蛋白特異性IgY作為一種CDI或rCDI患者的替代性治療或輔助治療方法的可行性。觀察結(jié)果表明，對倉鼠CDI提供良好保護(hù)的FliD-特異性IgY制劑與這些抗體抑制艱難梭菌黏附于結(jié)腸T84細(xì)胞的卓越效果有關(guān)（圖2）。

除了在艱難梭菌定植過程中的重要作用外，F(xiàn)liD-特異性IgY制劑在治療倉鼠CDI中的成功也可能與抗體似對抗原決定簇具有高親和力以及FliD蛋白接觸到抗原決定簇的數(shù)量有關(guān)。即使稀釋100 000倍，F(xiàn)liD-特異性IgY制劑在Western免疫印跡中的反應(yīng)性（圖3b）證明這些多克隆抗體仍對FliD抗原上抗原決定簇具有親和力。IgY制劑的高親和力也可能表示在通過宿主胃腸道期間高比例抗體的優(yōu)勢。如果存活的成分仍然能夠使致病菌失能，到達(dá)感染腸道部位時有多少制劑仍然保持物理完整性和活性并不重要。

原題名：Therapeutic potential of egg yolk antibodies fortreating Clostridium difficile infection （英文）

原作者： G. L. Mulvey等（加拿大卡爾加里大學(xué)）

參考文獻(xiàn)：（略）