甘蔗優(yōu)良DSE促生菌株的篩選及田間接種效果

覃麗萍 蘇琴 張?chǎng)? 謝玲 農(nóng)倩 張艷 陳艷露

摘 ?要 ?深色有隔內(nèi)生真菌（DSE）是一類與植物互惠共生的內(nèi)生真菌，研究DSE對(duì)甘蔗苗生長(zhǎng)的影響，為探索其在甘蔗生產(chǎn)節(jié)肥減耗和保護(hù)蔗地生態(tài)系統(tǒng)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。通過DSE與甘蔗組培苗的室內(nèi)共生試驗(yàn)進(jìn)行初步篩選，然后采用5×105 cfu/mL菌液淋根的方法在室內(nèi)盆栽條件下進(jìn)行復(fù)篩，再選用潛力菌株在田間測(cè)試其對(duì)甘蔗生長(zhǎng)的影響，以期篩選出對(duì)甘蔗具有明顯促生效果的DSE菌株。結(jié)果表明：在盆栽條件下所有DSE菌株（組合）接種甘蔗后甘蔗的株高、總鮮重、地上部干重和總干重與對(duì)照相比均有不同程度的提高，提高范圍分別在11.4%～30.9%、7.5%～65.3%、5.3%～58.0%和6.0%～64.7%;9個(gè)菌株（組合）接種甘蔗后甘蔗的地下部干重比對(duì)照增加了0.7%～103.6%不等;在田間試驗(yàn)中，8個(gè)菌株（組合）中有7個(gè)接種甘蔗后甘蔗的總鮮重比對(duì)照提高了2.0%～50.1%，其中的3個(gè)菌株處理使甘蔗的株高提高了6.9%～10.0%。表明DSE真菌對(duì)提高甘蔗的生產(chǎn)能力和保護(hù)蔗地的生態(tài)環(huán)境具有較好的開發(fā)利用潛力。

關(guān)鍵詞 ?深色有隔內(nèi)生真菌（DSE）;甘蔗;促生

中圖分類號(hào) ?S566.1 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Selection of Excellent Sugarcane Growth-promoting DSE

Strains and Their Inoculation Effects in Fields

QIN Liping1，2， SU Qin1， ZHANG Wenlong1，2， XIE Ling1，2*，

NONG Qian1，2， ZHANG Yan1， CHEN Yanlu1

1 Microbiology Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning，Guangxi 530007，China

2 Guangxi Crop Genetic Improvement And Biotechnology Laboratory，Nanning，Guangxi 530007，China

Abstract ?Dark septate endophytes（DSE）is a group of plant symbiotic fungi. The effects of DSE fungi on sugarcane seedling growth were evaluated to provide a reference for the application of DSE on the energy saving in sugarcane production and the conservation of sugarcane filed ecosystem. Based on initial screening by symbiotic culture of DSE and sugarcane in petri dishs， the effects of inoculation of DSE fungi on sugarcane were carried out in pot tests and in fields by pouring root with 5×105 cfu/mL mycelial suspension. It was found that the sugarcane plant height， fresh weight， shoot dry weight and biomass was increased 11.4%～30.9%， 7.5%～65.3%， 5.3%～58.0% and 6.0%～64.7% after inoculation with different DSE strains （combined strains） in pot tests， ?and the root biomass of 9 treatments （combined strains） increased 0.7%～103.6%， relative to the control. In field tests， the fresh weight of 7 treatments （combined strains） increased by 2.0%～50.1%， and the plant height of 3 treatments increased by 6.9%～10.0% compared to the control. It suggests that DSE fungi have a practical application value on raising sugarcane production capacity and the conservation of sugarcane filed ecosystem.

Key words ?Dark Septate Endophytes;Sugarcane;Growth-promoting

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.10.023

甘蔗（Saccharum officinarum）是中國(guó)最主要的糖料作物，在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中具有重要地位。廣西是中國(guó)最大的甘蔗產(chǎn)區(qū)，種植面積和蔗糖產(chǎn)品居全國(guó)首位。然而由于廣西地處丘陵地帶，蔗作區(qū)主要是赤紅壤，土壤肥力差，主要依靠大量施用化肥來保證產(chǎn)量，不但種植成本高，缺乏市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，還使土壤理化性狀和生態(tài)環(huán)境逐漸惡化[1-2]。因此，利用自然生態(tài)系統(tǒng)中共生微生物的促生潛能，改善蔗作區(qū)生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)甘蔗生長(zhǎng)，減少化肥的施用量，對(duì)保護(hù)環(huán)境、農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

深色有隔內(nèi)生真菌（dark septate endophytes， DSE）是植物共生真菌的典型代表之一，泛指一類定殖于健康植物體內(nèi)而對(duì)宿主無致病性的真菌。對(duì)DSE的研究始于20世紀(jì)，研究?jī)?nèi)容主要有DSE的多樣性、分類學(xué)、地理分布和生態(tài)學(xué)功能等，已研究過的DSE宿主植物有數(shù)百種。在中國(guó)，DSE的研究歷史僅有十來年，研究非常少且不夠深入，主要是對(duì)一些中草藥（如三七、沙冬青、雪蓮、枸杞）、紅樹及重金屬礦區(qū)、荒漠地區(qū)植被中DSE的分布和定殖情況進(jìn)行調(diào)查研究[3-9]。

目前DSE的研究尚處于初始階段，有很多問題還不清楚，關(guān)于其潛在的生態(tài)學(xué)功能就有多種觀點(diǎn)，但越來越多的研究結(jié)果表明，DSE能夠與宿主建立互惠共生的關(guān)系，提高植物性能。將DSE接種于玉米、水稻、甜高粱等禾本科作物后，對(duì)宿主的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用[8，10-12]，甘蔗作為禾本科作物中重要的一員，DSE極有可能也定殖其中并促進(jìn)其生長(zhǎng)。為此筆者對(duì)一些DSE菌株進(jìn)行了一系列的篩選試驗(yàn)，以期找到對(duì)甘蔗具顯著促生作用的DSE菌株，探索出有效、可行的田間接種方法，為今后菌劑的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試甘蔗 ? 室內(nèi)平皿試驗(yàn)品種為桂糖28號(hào)，盆栽試驗(yàn)、田間試驗(yàn)品種為桂糖32號(hào)。

1.1.2 ?供試菌株 ? 供試菌株由本課題組從廣西甘蔗根圍、大石圍天坑群植被根圍分離獲得或從國(guó)外引進(jìn)，并已確定為DSE真菌。

1.1.3 ?供試培養(yǎng)基 ? CMMY培養(yǎng)基：麥芽汁瓊脂10 g，玉米粉瓊脂8.5 g，酵母粉2 g，瓊脂粉7.5 g，蒸餾水1 000 mL ，自然pH值;燕麥培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 1 g，KH2PO4 1.5 g，NaNO3 1 g，燕麥粉10 g，瓊脂粉7.5 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH值;PDB培養(yǎng)基：新鮮馬鈴薯200 g，葡萄糖15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0。

1.2 ?方法

1.2.1 ?平皿篩選 ? 將供試菌株接種于燕麥培養(yǎng)基上，每皿接3個(gè)菌塊，培養(yǎng)10～15 d待菌落長(zhǎng)大后備用。選擇長(zhǎng)勢(shì)基本一致的甘蔗組培苗移栽至菌落上，根系平鋪于菌落表面，每個(gè)菌落上移栽1株苗，每皿栽3株，放入塑料組培瓶中，于25 ℃、光照強(qiáng)度180 μmol/（m2.s2）、光照時(shí)間為16 h/d的培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)30 d。以未接種DSE的處理為對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 ?盆栽試驗(yàn)甘蔗的種植 ? 將甘蔗組培苗在營(yíng)養(yǎng)杯中煉苗，待其長(zhǎng)至5～7葉后，選取長(zhǎng)勢(shì)較均勻的植株移栽至高19 cm、直徑15 cm的塑料花盆中，每盆種4株，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)基質(zhì)為稻田土 ∶ 滅菌腐殖質(zhì)=4 ∶ 3（V/V）。

1.2.3 ?田間試驗(yàn)甘蔗的種植 ? 將甘蔗組培苗根部洗凈并種植于育苗杯中，每杯種1株。育苗基質(zhì)為泥炭 ∶ 育苗土=1 ∶ 1（m/m），再加1%米糠和1%木屑（于121 ℃間歇滅菌2次，每次30 min）。30 d后將甘蔗苗移植于大田，每處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)種10株苗，行距為65 cm，株距為30 cm，四周各設(shè)2行保護(hù)行。

1.2.4 ?菌液的制備 ? 將菌株在CMMY平板上培養(yǎng)約10 d，轉(zhuǎn)接于PDB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)（28 ℃，120 r/min）10～15 d;用滅菌紗布過濾收集菌絲體，用無菌水沖洗數(shù)次，將菌絲團(tuán)打碎，配成5×105 cfu/mL的菌液備用（組合菌株處理：以等量菌液混合配制）。

1.2.5 ?盆栽試驗(yàn)接種方法 ? 待甘蔗苗移栽10 d后，將菌液淋于其根部，每盆淋200 mL，以淋等量無菌水作為對(duì)照。每15 d淋一次，共淋3次。

1.2.6 ?田間試驗(yàn)接種方法 ? 待甘蔗苗于育苗杯中種植7 d后，將菌液淋于根部，共淋2次，第一次每杯淋5 mL，第二次每杯淋10 mL。將甘蔗苗移栽至大田后，處理4和處理6（處理方法詳見表1）再分別淋2次，第一次淋20 mL/株，第二次淋50 mL/株。每次淋菌時(shí)間間隔15 d，以淋等量無菌水作為對(duì)照。

1.2.7 ?調(diào)查方法 ? 平皿試驗(yàn)中，共培養(yǎng)30 d后將蔗苗根部培養(yǎng)基洗凈，置于50 ℃烘箱中烘干，稱量干重;盆栽試驗(yàn)中，最后一次淋菌后2 個(gè)月取全部植株調(diào)查;田間試驗(yàn)中，最后一次淋菌后8 個(gè)月調(diào)查，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取4蔸。調(diào)查方法：將根部洗凈，于室內(nèi)晾干水，記錄株高，稱量鮮重，于50 ℃烘箱中烘干，稱量干重。

1.3 ?數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 ? 用Excel 2007和DPS6.55數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?平皿篩選結(jié)果

供試的19個(gè)菌株中有12個(gè)表現(xiàn)出一定的促生能力，甘蔗接種其后干重較對(duì)照有所增加，其中以接種3TK4-2-4的增幅最大（101.45%），其次是接種26R-5時(shí)增幅達(dá)67.4%，與對(duì)照相比差異分別達(dá)極顯著、顯著水平。接種其余7個(gè)菌株后甘蔗干重較對(duì)照的輕，降幅在0.1%～49.9%之間，其中接種G-X-2、TK5-6-6時(shí)甘蔗干重與對(duì)照相比差異達(dá)極顯著水平，接種3TK6-2-7時(shí)干重與對(duì)照相比差異達(dá)顯著水平（圖1）。DSE對(duì)甘蔗生長(zhǎng)的影響情況見圖2。

2.2 ?盆栽試驗(yàn)結(jié)果

接種不同DSE菌株的甘蔗株高均高于對(duì)照，增幅在11.4%～30.9%之間，其中接種LTVB3和J2PC4的2個(gè)處理與對(duì)照的差異達(dá)極顯著水平（表2），接種L-14、L-1、26R-5+TK2-2-1、J-N3、BPC1、TK2-2-1的處理與對(duì)照的差異達(dá)顯著水平，其余7個(gè)處理與對(duì)照相比均未達(dá)到差異顯著水平。

甘蔗接種DSE后各處理的總鮮重均高于對(duì)照，增幅在7.5%～65.3%之間，其中以接種TK2-2-1的處理總鮮重最大，并與對(duì)照達(dá)到差異顯著水平，而其他處理與對(duì)照的差異均未達(dá)到顯著水平。

有9個(gè)處理的甘蔗地下部干重均高于對(duì)照，增幅在0.7%～103.6%之間，其中接種TK2-2-1的處理極大地增加了地下部的干重，比對(duì)照增加了103.6%，差異極為顯著，其余8個(gè)處理與對(duì)照相比差異不顯著。所有處理的甘蔗地上部干重和總干重均比對(duì)照高，增加范圍在5.3%～58.0%和6.0%～64.7%之間，接種TK2-2-1的處理與對(duì)照達(dá)到差異顯著水平，其他處理與對(duì)照的差異不顯著（表2）。DSE在甘蔗根部定殖形成的深色有隔菌絲見圖3。

2.3 ?田間試驗(yàn)結(jié)果

2個(gè)接種混合菌劑（26R-5+TK2-2-1+TK8-1-5）的處理和接種TK2-2-1 4次的處理甘蔗株高均比對(duì)照的稍高，分別增高了7.5%、9.9%和6.9%，但差異不顯著。除接種26R-5+TK2-2-1的處理外，其他處理的甘蔗鮮重均比對(duì)照的重，增重幅度在2.0%～50.1%之間，其中接種26R-5和接種26R-5+TK2-2-1+TK8-1-5混合菌劑4次的處理與對(duì)照相比，差異達(dá)顯著水平。所有處理的甘蔗有效分蘗數(shù)均比對(duì)照的多，其中接種26R-5的處理與對(duì)照的差異達(dá)顯著水平。而所有處理甘蔗的糖度與對(duì)照相比均無顯著差異，說明接種DSE對(duì)甘蔗的糖度沒有影響（表3）。

3 ?討論與結(jié)論

所有菌株接種甘蔗后對(duì)宿主均無致病性，且在甘蔗根系中可觀察到深色有隔菌絲，這是DSE的侵染特征之一，表明這些菌株為DSE真菌。甘蔗苗接種DSE后株高、鮮重、干重都有不同程度的提高，表明DSE能夠定殖于甘蔗并與之建立共生體系，促進(jìn)甘蔗的生長(zhǎng)。Newsham[13]統(tǒng)計(jì)分析了來自不同國(guó)家（地區(qū)）的18個(gè)獨(dú)立的DSE平皿接種試驗(yàn)結(jié)果，顯示接種DSE可提高不同宿主植物的總生物量、地下部生物量及植株N、P含量，本研究的結(jié)果與前人的研究結(jié)果基本一致。

本研究中同一DSE菌株在不同的接種試驗(yàn)中促生效果有所偏差，可能是由于培養(yǎng)基的養(yǎng)分與土壤的養(yǎng)分不同，從而造成定殖率不同。DSE在宿主植物中的定殖率除與菌株自身有關(guān)外，還與儲(chǔ)多營(yíng)養(yǎng)因子（如土壤中的有機(jī)質(zhì)、堿解N和速效K等）有直接關(guān)系[14]。培養(yǎng)基中N的形態(tài)也影響DSE的促生效果，Newsham[13]和Mmhmoud等[15]發(fā)現(xiàn)DSE在以有機(jī)N為N源的培養(yǎng)基中促生效果尤佳。DSE幾乎沒有宿主特異性[16]，而同一種植物不同品種對(duì)它的定殖率是否有影響并未見相關(guān)報(bào)道，因此其促生效果是否與甘蔗品種不同有關(guān)尚有待探究。

DSE對(duì)包括甘蔗在內(nèi)的作物的促生效果已有相關(guān)研究報(bào)道[8，12，17]，但還停留在室內(nèi)的平皿試驗(yàn)或盆栽試驗(yàn)。本研究經(jīng)過平皿、盆栽的篩選試驗(yàn)，最后到田間進(jìn)行初步的應(yīng)用試驗(yàn)，類似的DSE在作物生產(chǎn)上的應(yīng)用研究鮮見報(bào)道。

綜合3個(gè)接種試驗(yàn)來看，TK2-2-1和26R-5的促生效果相對(duì)比較好且較為穩(wěn)定，TK2-2-1能顯著促進(jìn)甘蔗地下部生長(zhǎng)，26R-5在促進(jìn)甘蔗分蘗方面比較突出，因此這2個(gè)菌株具有良好的能夠被開發(fā)利用為促生菌的潛能。DSE具有多種潛在的生態(tài)學(xué)功能[18-21]，稻鐮狀瓶霉（Harpophora orvzae）對(duì)水稻不僅有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，還能增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟病的抗病能力[12，22]。TK2-2-1和26R-5能否提高甘蔗的抗病能力還需今后通過測(cè)試它們對(duì)甘蔗重要病害的生防效果來進(jìn)一步探討，這些菌株其他的功能如增強(qiáng)宿主抗旱能力等也將是今后值得關(guān)注的焦點(diǎn)。

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