東北虎圈養(yǎng)環(huán)境土壤中蛔蟲蟲卵的分離與鑒定

張長生　彭智偉　史沁欣　郝春曉　侯志軍

摘要 [目的] 對東北虎圈養(yǎng)環(huán)境土壤中蛔蟲蟲卵進行分離與鑒定。[方法]對黑龍江某虎園內(nèi)的土壤進行隨機采樣，對蛔蟲蟲卵進行分離，通過形態(tài)學(xué)鑒定、分子生物學(xué)鑒定和分子進化樹對其進行鑒定。[結(jié)果] 通過形態(tài)學(xué)鑒定確定土壤中含有2種形態(tài)的蟲卵。分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明該蟲卵分別是是獅弓蛔蟲蟲卵和貓弓首蛔蟲蟲卵。分子進化樹分析結(jié)果表明獅弓蛔蟲屬于弓蛔屬，貓弓首蛔蟲屬于弓首屬。[結(jié)論]通過形態(tài)學(xué)觀察、分子鑒定和進化樹分析確定土壤中含有獅弓蛔蟲蟲卵和貓弓首蛔蟲蟲卵。

關(guān)鍵詞 東北虎；土壤；獅弓蛔蟲；貓弓首蛔蟲；分子生物學(xué)鑒定

中圖分類號 S85 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）11-127-02

蛔蟲病的流行極廣[1]，貓科動物蛔蟲病的病原體有弓首科弓首屬的貓弓首蛔蟲（Toxocara cati）和蛔科弓蛔屬的獅弓蛔蟲（Toxascaris leonina）。貓弓首蛔蟲是貓科動物常見的寄生蟲病。據(jù)調(diào)查貓弓首蛔蟲在貓科動物中感染率很高，為25.2%～66.2%[2]。蛔蟲病可導(dǎo)致動物營養(yǎng)不良、貧血、精神沉郁和生長發(fā)育受阻，幼小動物甚至死亡[3-5]?；紫x的發(fā)育主要分為蟲卵、幼蟲和成蟲。感染期是在蟲卵和幼蟲的階段。經(jīng)過4次蛻皮后進入到成蟲期，蛻皮是蛔蟲發(fā)育過程中最顯著的特征之一?；紫x在幼蟲期是無增殖的。蟲卵是在外界土壤中發(fā)育的，而蟲體是在生物體內(nèi)寄生[6-8]。筆者對散養(yǎng)園內(nèi)的土壤進行隨機采樣分析，通過形態(tài)學(xué)鑒定可判斷土壤中含有2種形態(tài)的蟲卵，通過分子生物學(xué)鑒定確定該蟲卵分別是獅弓蛔蟲蟲卵和貓弓首蛔蟲蟲卵，最后構(gòu)建進化樹確定其分類地位。

1 材料與方法

1.1 樣品材料 土壤來自于黑龍江某虎園。

1.2 試劑 飽和硝酸鹽溶液、5%氫氧化鈉溶液、蛋白酶K、組織細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒（原平皓生物技術(shù)有限公司）產(chǎn)品、rTaq酶、DNA Maker DL2000T（寶生物工程有限公司）產(chǎn)品；DNA膠回收試劑盒，為OMEGA公司產(chǎn)品。

1.3 鏡檢方法 采用飽和硝酸鈉漂浮法檢查土壤中蛔蟲卵[9]。

1.4 蟲卵DNA的提取 將保存的蟲卵液用研磨器研磨10 min后，加入20 μl蛋白酶K 37 ℃水浴過夜。使用組織細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA，-20 ℃下保存。

1.5 PCR引物設(shè)計 根據(jù)GenBank上貓弓首蛔蟲ITS-I序列隨即設(shè)計1對特異性引物，上游引物：5-GTGTTGAGGGGAAATGGGTGAC- 3，下游引物：5-CAATGTGCGTTCGAAATGTTAG -3，長度大約為414 bp。根據(jù)保守引物NC5/NC2對獅弓蛔蟲的整個ITS序列進行擴增，上游引物NC5：5-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3； 下游引物NC2：5-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3。目的片段長度約為867 bp。

1.6 PCR反應(yīng) 采用25 μl PCR體系：10×PCR Buffer 2.5 μl、MgCl2 2 μl、dNTP 2.5 μl、上下游引物各1 μl、雙蒸水12 μl、Taq酶1 μl、模版3 μl。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性，5 min； 94 ℃變性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃延伸10 min，32個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳下進行觀察。

1.7 擴增片段的克隆及篩選使用DNA膠回收試劑盒對擴增片段進行純化，純化后產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，振蕩培養(yǎng)后涂布在含Amp的LB上，過夜培養(yǎng)后挑選白色的單菌落，對菌落進行PCR鑒定，篩選陽性克隆并進行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛔蟲蟲卵的形態(tài)結(jié)構(gòu) 在顯微鏡下觀察，獅弓蛔蟲蟲卵呈橢圓形，外有1層光滑的殼，呈黃褐色，大小為82.59 μm×64.54 μm。貓弓首蛔蟲蟲卵呈的蟲卵呈亞球形，卵殼凹凸不平，大小為66.18 μm×76.40 μm（圖1）。

2.2 PCR擴增結(jié)果 用保守引物NC5/NC2對獅弓蛔蟲進行擴增，得到857 bp大小的片段（圖2）。特異性引物對貓弓首蛔蟲進行擴增，得到416 bp大小的片段（圖3）。

2.3 獅弓蛔蟲和貓弓首蛔蟲的ITS-I序列比較結(jié)果使用MEG4.1生物軟件對獅弓蛔蟲和貓弓首蛔蟲的基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫上的其他蛔蟲的ITS-I序列建立系統(tǒng)進化樹分析，包括寄生在人和豬小腸內(nèi)的蛔蟲（Ascaris）； 寄生在貓、狗、狐、狼、獅等食肉動物體內(nèi)的弓蛔蟲（Toxocara）； 寄生在雞等家禽的禽蛔蟲（Ascaridia）； 寄生驢、馬的副蛔蟲

（Parascaris）； 寄生在蛙、蛇等兩棲、爬行動物的蛇蛔蟲（Ophidascaris）。遺傳進化樹分析結(jié)果表明，15種蛔蟲的ITS-1基因可大致分為2組。該試驗的獅弓蛔蟲屬于弓蛔屬，貓弓首蛔蟲屬于弓首屬。其中，貓弓首蛔蟲與馬來西亞弓首蛔蟲的親緣關(guān)系較近，同源性為98.3%；獅弓蛔蟲與貓弓首蛔蟲的同源性為80.5%（圖4）。

3 討論

蛔蟲生活史簡單，雌蟲產(chǎn)卵量大，蟲卵對外界環(huán)境的抵抗力強，如果用未經(jīng)處理的糞便施肥，糞便中的蛔蟲卵可能會廣泛污染土壤和周圍環(huán)境[10]。筆者對虎園散養(yǎng)圈內(nèi)所采的10份土樣進行蟲卵形態(tài)學(xué)觀察，在其中1份中發(fā)現(xiàn)蛔蟲蟲卵，從形態(tài)學(xué)上初步鑒定為獅弓蛔蟲和貓弓首蛔蟲，同時又用分子方法進一步證明確定所觀察到的蛔蟲蟲卵為獅弓蛔蟲和貓弓首蛔蟲，所得序列與GenBank已知的其他蛔蟲的序列進行比較發(fā)現(xiàn)，獅弓蛔蟲屬于弓蛔屬，貓弓首蛔蟲屬于弓首屬，隨機采取的土樣中蛔蟲蟲卵已經(jīng)不能用麥克馬斯特法測定其EPG值，僅能通過飽和硝酸鈉漂浮法檢測是否為陽性，說明土壤中蛔蟲卵的數(shù)量較少。

蛔蟲的感染會對東北虎的健康造成很大的影響，但在現(xiàn)有的條件下很難將東北虎蛔蟲病根治，只能將其感染率及感染強度降到最低。每次在群投驅(qū)蟲時，要更換不同的驅(qū)蟲藥，避免蛔蟲產(chǎn)生耐藥性，從而導(dǎo)致驅(qū)蟲藥失效。圈養(yǎng)東北虎要與散養(yǎng)東北虎隔絕開來，避免交叉感染。發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重食欲不振、消瘦的東北虎時應(yīng)特別注意，必要時要單獨進行驅(qū)蟲。建議對園內(nèi)的動物進行定期驅(qū)蟲，尤其是對象東北虎等感染較為嚴(yán)重的動物，可根據(jù)實際情況定期采集新鮮糞便送往實驗室檢查，根據(jù)感染程度制定相應(yīng)的驅(qū)蟲措施，以防止蛔蟲病的爆發(fā)[11]。

該研究結(jié)果不僅為研究獅弓蛔蟲和貓弓首蛔蟲的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)生等奠定了基礎(chǔ)，而且亦為研究蛔蟲病是否與動物采食被感染性蟲卵污染的土壤、飼料和水提供理論借鑒。

參考文獻

[1] 許萬祥.豬蛔蟲病的診斷與防治[J].畜牧與飼料科學(xué)，2009（7）：192-194.

[2] 劉建立，侯志軍，華育平，等.黑龍江東北虎林園貓科動物體內(nèi)寄生蟲感染調(diào)查[J].野生動物雜志，2007，28（3）：26-28.

[3] 孔繁瑤.家畜寄生蟲學(xué)[M].2版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1997.

[4] 李明偉，林瑞慶，朱興全.弓首蛔蟲病研究進展[J].中國人獸共患病雜志，2005，21（11）：25-29.

[5] 趙廣英.東北虎獅弓蛔蟲感染的綜合防制及曼氏迭宮絳蟲的形態(tài)觀測[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2001.

[6] 楊敦敬.園林動物寄生蟲調(diào)查[M].北京：中國動物園年刊，1983：151-161.

[7] GEENENP L，BRESEIANI J，BOES J，et al.The monphogenesis of Ascaris suum to the infeetivev Third- stage larvae Within the egg[J].Jparasitol，1999，85（4）：616-622.

[8] MAUNG M.The occurrence of the seeond molt of Ascaris lumbricoides and Ascaris suum[J].Int Jparasitol，1978（8）：371-378.

[9] 中國疾病預(yù)防控制中心.全國土源性線蟲病監(jiān)測方案操作手冊[Z].2006.

[10] 李雍龍.人體寄生蟲學(xué)[M].7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：164.

[11] 菅復(fù)春，朱金鑫，趙金鳳，等.鄭州市動物園東北虎和非洲獅蛔蟲感染情況調(diào)查與防治[J].中國畜牧獸醫(yī)，2007，34（8）：78-80.

責(zé)任編輯 陳玉敏 責(zé)任校對 李巖