兩棲類壺菌病3種PCR鑒定方法與比較

李斌　黃艷　王宇　邵晨

摘要 壺菌病是一種新型的由蛙壺菌感染所引起的兩棲動物傳染疾病，其快速的傳染性和廣泛的暴發(fā)性導(dǎo)致兩棲類物種的大面積滅絕，對全球兩棲動物的生存產(chǎn)生了巨大影響。介紹了3種鑒定蛙壺菌的PCR方法：常規(guī)PCR、巢式PCR和實時定量PCR，并對這3種方法進行分析與比較。

關(guān)鍵詞 壺菌病；蛙壺菌；兩棲動物；PCR

中圖分類號 S188 文獻標(biāo)識碼A 文章編號 0517-6611（2015）11-032-03

蛙壺菌（Batrachochytrium dendrobatidis）是壺菌門（Chytridiomycota）、壺菌綱（ Chytridiomycetes）、壺菌目（Chytridiales）的一個新屬（Batrachochytrium），且蛙壺菌是該屬的唯一物種[1]。蛙壺菌可在4～25 ℃的溫度下生長，最適溫度17～25 ℃，它們可以在寄主身上過冬。但蛙壺菌對熱較敏感，在25 ℃以上的環(huán)境中生長較差，若高于28 ℃，生長就會停止，且在37 ℃加熱4 h或47 ℃加熱30 min或60 ℃加熱5 min 致死率將達到100%[2]。蛙壺菌具有快速的傳染性和廣泛的暴發(fā)性，但同時其傳染性和暴發(fā)性具有明顯的季節(jié)性和地域性。壺菌病在冬季暴發(fā)率較高，且多發(fā)生在高海拔地區(qū)和某些熱帶雨林山區(qū)[3]。蛙壺菌主要寄生于無尾兩棲類成體皮膚和蝌蚪口器中，通過寄主生活的水體進行傳播，患病的蛙和蝌蚪攜帶的蛙壺菌游動孢子會隨表皮角質(zhì)層脫落而被釋放到水中，健康蛙和蝌蚪則會因接觸含蛙壺菌游動孢子的水而感染壺菌病[4]。蛙壺菌主要通過影響蛙體皮膚的功能來影響其機體的生理機能，皮膚對兩棲動物保持物質(zhì)轉(zhuǎn)運和電解質(zhì)平衡具有重要作用，個體感染蛙壺菌后，依賴皮膚的電解質(zhì)轉(zhuǎn)運被抑制率達50%以上，血漿鈉、鉀濃度分別減少了20%和50%，嚴(yán)重影響了心肌功能，從而導(dǎo)致心跳驟停而死亡[5]。

壺菌病廣泛性暴發(fā)是導(dǎo)致全球兩棲類種群數(shù)量急劇下降的主要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)此病自1978年已經(jīng)遍布整個澳洲，目前非洲、南美洲、北美洲、歐洲和亞洲均發(fā)現(xiàn)兩棲動物感染蛙壺菌[1，6-16]。自2010年國內(nèi)首次報道在云南的滇蛙（Rana pleuraden）、牛蛙（Rana catesbeiana）、云南臭蛙（Odorrana andersonii）、昭覺林蛙（Rana chaochiaoensis）中發(fā)現(xiàn)蛙壺菌感染以來，四川、湖北、貴州、湖南、浙江、北京、天津、河北的石家莊以及河南的鄭州在野外均發(fā)現(xiàn)蛙壺菌的分布[15-16]。同時，研究表明在20世紀(jì)八九十年代的國內(nèi)館藏標(biāo)本中也檢測到蛙壺菌的DNA分子[17-18]。說明我國兩棲類蛙壺菌的感染可能要追溯到20世紀(jì)八九十年代，甚至更早。目前，壺菌病檢測主要依賴組織學(xué)、免疫組織化學(xué)以及PCR等方法，但組織學(xué)和免疫組織化學(xué)法對壺菌病感染早期不敏感，且對蛙體的正常生存具有一定影響。用常規(guī)PCR或改進的巢式PCR和實時定量PCR技術(shù)，靈敏性和特異性相對較高，有助于在飼養(yǎng)和野生的兩棲動物種群中及早發(fā)現(xiàn)蛙壺菌[19-20]。筆者對常規(guī)PCR、巢式PCR和實時定量PCR在蛙壺菌檢測中的應(yīng)用分別進行概述，并對這3種PCR方法的優(yōu)缺點進行分析與比較，為兩棲類壺菌病檢測方法的選擇提供參考。

1 蛙壺菌的PCR檢測方法

1.1 常規(guī)PCRPCR（polymerase chain reaction，PCR）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，它是一種體外快速擴增特定DNA片段的方法。1985年，美國Mullis等[21]學(xué)者首創(chuàng)了PCR 技術(shù)，并由美國PE-Cetus 公司開發(fā)研制。 PCR反應(yīng)中，利用堿基互補配對的原理，通過雙鏈DNA的高溫變性（denaturation）、低溫退火（annealing）和適溫延伸（extension）3步實現(xiàn)一個循環(huán)，在不斷循環(huán)中，每一循環(huán)所合成的新DNA鏈，又作為下一循環(huán)中的模板，擴增產(chǎn)物的量以指數(shù)級方式增加，一般單一拷貝的DNA片段擴增循環(huán)25～30 次，可擴增l00 萬～200 萬倍[22]。自PCR 技術(shù)問世以來，已在微生物檢測、臨床診斷、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，如姜莉莉等[23]選擇外毒素A基因（PEA）作為 PCR 檢測的目標(biāo)基因，建立了水貂綠膿桿菌 PCR 快速檢測方法；張立軍等[24]通過PCR技術(shù)鑒定擬南芥T-DNA 插入突變體atsuc3等。

Annis等[19]在利用常規(guī)PCR對蛙壺菌進行檢測時，根據(jù)蛙壺菌位于5.8 S rDNA的特異性DNA片段設(shè)計引物，通過設(shè)計的引物Bd1a（5′-CAGTGTGCCATATGTCACG-3′）和Bd2a（5′-CATGGTTCATATCTGTCCAG-3′）進行PCR擴增得到目的片段[19]，回收和純化目的片段，再將得到的目的片段進行轉(zhuǎn)化、克隆、測序，最后將得到的序列與GenBank中已發(fā)表的蛙壺菌基因序列進行序列分析。

1.2 巢式PCR巢式PCR（Nested PCR）是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的DNA擴增技術(shù)，具有較高的特異性和靈敏度，巢式PCR甚至可以在污染或已經(jīng)降解的樣本中進行DNA擴增[25]。其高特異性和靈敏度使得它在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究方面都有廣泛應(yīng)用[26-28]。巢式PCR通過兩輪PCR反應(yīng)，使用兩套引物擴增特異性的DNA片斷。 第一輪擴增中，外引物用以擴增得到特異性的DNA片段，作為第二輪擴增的模板，第二對引物特異性的擴增位于首輪PCR產(chǎn)物內(nèi)的一段DNA片斷，得到擴增的目的片段[29]。兩輪PCR反應(yīng)增加了目的基因的數(shù)量，從而提高了檢測靈敏度[30]。

2005年Garner等[9]采用巢式PCR對歐洲壺菌病進行研究，結(jié)果表明蛙壺菌在歐洲具有廣泛而不規(guī)則的分布。2009年Gaertner等[31]利用巢式PCR對美國德州5種地方性蠑螈的壺菌病調(diào)查中發(fā)現(xiàn)5種蠑螈都存在一定程度的蛙壺菌感染，同年，Goka等[32]同樣使用巢式PCR對日本壺菌病進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在部分兩棲動物中也存在壺菌病，另外，2012年Bai等[16]使用巢式PCR對我國壺菌病的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)云南、貴州、浙江等10省中均有蛙壺菌分布。在使用巢式PCR檢測蛙壺菌中，蛙壺菌的一段特異性DNA片段是位于ITS4和ITS5（ITS：轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）之間的一段DNA序列（圖1），試驗中可以使用真菌通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）進行PCR擴增，得到一段特異性的DNA片段[33]。以得到的DNA片段作為模板，使用蛙壺菌特異性引物Bd1a（5′-CAGTGTGCCATATGTCACG-3′）和Bd2a（5′-CATGGTTCATATCTGTCCAG-3′）進行PCR擴增[19]，后續(xù)步驟與常規(guī)PCR類似，將得到的目的片段依次進行回收、純化、轉(zhuǎn)化、克隆和測序，最后將得到的序列與GenBank中已發(fā)表的蛙壺菌基因序列進行序列分析。

1.3 實時定量PCR實時定量PCR（real-time TaqMan PCR）是由美國Applied Biosystems公司于1996年研發(fā)的一種新型實時定量檢測特定核酸技術(shù)，該技術(shù)將核酸探針技術(shù)、PCR技術(shù)、熒光共振能量傳遞技術(shù)和光譜技術(shù)有機結(jié)合起來，在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針來實現(xiàn)其實時定量功能[34-35]。

2006年Garner等[36]對北美洲的加拿大、美國等8個國家的牛蛙（Rana catesbeiana）壺菌病研究中發(fā)現(xiàn)7個國家的牛蛙中都檢測到蛙壺菌感染。同年，Kriger等[37]對野外101只巨型斑蟾（Mixophyes iteratus）使用實時定量PCR和組織學(xué)方法對蛙壺菌進行檢測，結(jié)果表明實時定量PCR的靈敏度明顯高于組織學(xué)檢測方法。2010年Bai等[15]在我國云南5種兩棲動物中的4個物種中檢測到壺菌病。Bataille等[13]對韓國壺菌病分布情況研究中發(fā)現(xiàn)壺菌病已在韓國廣泛傳播。以上幾項調(diào)查研究中均使用實時定量PCR技術(shù)，在使用實時定量PCR檢測蛙壺菌時，引物和探針一般采用通用壺菌檢測引物和探針：

引物：ITS1-3 Chytr：5′-CCTTGATATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′；

5.8S Chytr：5′-AGCCAAGAGATCCGTTGTCAAA-3′；

探針：ChytrMGB： 5′-6FAM CGAGTCGAACAAAAT MGBNFQ-3′。

在反應(yīng)條件上實時定量PCR與常規(guī)PCR和巢式PCR有所不同：50 ℃ 2 min，95 ℃ 15 min， 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，50個循環(huán)[20]。將得到的目的片段依次進行回收、純化、轉(zhuǎn)化、克隆和測序，最后將得到的序列與GenBank中已發(fā)表的蛙壺菌基因序列進行序列分析。

2 3種PCR鑒定方法的分析與比較

2.1 巢式PCR與常規(guī)PCR比較 常規(guī)PCR中使用Bd1a和Bd2a作為引物擴增出來的DNA條帶約為300 bp[19]。在巢式PCR中，第一步以ITS4和ITS5為引物擴增出的條帶約600bp，第二步PCR以Bd1a和Bd2a為引物擴增出目的片段[19]。由于模板和引物的改變，降低了非特異性反應(yīng)連續(xù)放大的可能性，保證了反應(yīng)的特異性；同時，第一步PCR的產(chǎn)物作為第二步PCR的模板，克服常規(guī)PCR“平臺期效應(yīng)”的限制，使擴增倍數(shù)提高，從而極大地提高了PCR的靈敏度；另外，內(nèi)側(cè)引物擴增的模板是外側(cè)引物擴增的產(chǎn)物，第二步PCR反應(yīng)能否順利進行，是對第一階段反應(yīng)正確性的鑒定，以增加了整個反應(yīng)的準(zhǔn)確性及可行性[29]。但經(jīng)過2次PCR反應(yīng)，在增加反應(yīng)的特異性、靈敏度、準(zhǔn)確性和可行性的同時也增加了兩步反應(yīng)之間試驗污染的概率。

2.2 實時定量PCR與常規(guī)PCR比較實時定量PCR中通過引物（ITS1-3 Chytr和5.8S Chytr）和探針（ChytrMGB）與模板的特異性雜交來鑒別模板，相對于常規(guī)PCR而言，具有較高的準(zhǔn)確性、特異性和較低的假陽性等優(yōu)點[37]；在實時定量PCR中將計算機和探針技術(shù)相結(jié)合，對試驗中每個循環(huán)都可以實時監(jiān)測，同時實現(xiàn)了PCR從定性到定量檢測的飛躍，提高了試驗的精確性，自動化程度較高，易于進行電腦化數(shù)據(jù)管理[38]。

2.3 巢式PCR與實時定量PCR比較巢式PCR和實時定量PCR都有各自的利弊，它們都具有特異性強、靈敏度高等優(yōu)點。進一步比較兩者，巢式PCR經(jīng)歷兩步PCR反應(yīng)會增加試驗中污染的概率，而實時定量PCR則是在一個封閉的環(huán)境中完成PCR過程，減少試驗中污染的可能性；而且，實時定量PCR還具有快速、自動化程度高、重復(fù)性好等特點[38]。另一方面，巢式PCR也有其優(yōu)越性：首先，巢式PCR在蛙壺菌檢測中具有比實時定量PCR更高的靈敏度；其次，若蛙壺菌DNA中具有相對保守性的ITS區(qū)中出現(xiàn)替換或缺失等突變時，實時定量PCR中的探針可能會出現(xiàn)與模板雜交失敗的情況，影響PCR的效果，巢式PCR則可以避免此類問題的出現(xiàn)[32]。Goka等[32]使用3種PCR方法對26種四大類不同基因型的蛙壺菌進行檢測，結(jié)果表明靈敏度由高到低依次為巢式PCR、實時定量PCR、常規(guī)PCR，另外，當(dāng)蛙壺菌在 ITS1-5.8S rDNA-ITS2 區(qū)域有替換或缺失時，只有巢式PCR的結(jié)果為陽性。

3 展望

兩棲動物種群全球性衰退是21世紀(jì)最緊迫的環(huán)境問題之一，全球2/3的兩棲動物種群面臨生存危機[39]。高致死性真菌病原體蛙壺菌是引起兩棲類種群數(shù)量急劇下降的主要原因之一，其驚人的傳播速度及廣泛暴發(fā)對世界范圍內(nèi)的兩棲動物種群數(shù)量構(gòu)成重大威脅。蛙壺菌己在世界各地發(fā)現(xiàn)并流行，我國具有豐富的兩棲動物資源和適合蛙壺菌生存的廣闊的地理環(huán)境，由于蛙類貿(mào)易的發(fā)展，壺菌病已在我國傳播蔓延。為了阻止壺菌病在我國進一步擴散蔓延與惡化，必須加強立法，在蛙類貿(mào)易進出口建立有效可靠的檢疫防御措施。因此，得到快速、靈敏、簡單、準(zhǔn)確的蛙壺菌檢測方法迫在眉睫。

另一方面，生物芯片（Biochip，又稱DNA芯片、基因芯片）技術(shù)日新月異，利用生物芯片技術(shù)在對核酸、蛋白質(zhì)、生物組織碎片或完整的活細胞進行檢測時具有大規(guī)模高通量、靈敏準(zhǔn)確、快速簡便等優(yōu)點[40-42]。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基因表達分析[43-45]、DNA序列測定[46-47]、新基因發(fā)現(xiàn)[48-49]、醫(yī)學(xué)診療[50-51]等方面。若能將生物芯片技術(shù)運用到蛙壺菌的檢測上，不僅可以快速方便準(zhǔn)確地檢測蛙壺菌的存在，而且可以同時檢測到不同種類的蛙壺菌，甚至明確不同蛙壺菌的基因型及菌株系。

參考文獻

[1]BERGER L，SPEARE R，DASZAK P，et al.Chytridiomycosis causes amphibian mortality associated with population declines in the rain forests of Australia and Central America[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，1998，95（15）：9031-9036.

[2] JOHNSON M L，BERGER L，PHILLIPS L，et al.Fungicidal effects of chemical disinfectants，UV light，desiccation and heat on the amphibian chytrid，Batrachochytrium dendrobatidis[J].Diseases of Aquatic Organisms，2003，57：255-260.

[3] DASZAK P，BERGER L，CUNNINGHAM A A，et al.Emerging infectious diseases and amphibian population declines[J].Emerg Infect Dis，1999，5（6）：735-748.

[4] RACHOWICZ L J，VREDENBURG V T.Transmission of Batrachochytrium dendrobatidis within and between amphibian life stages[J].Diseases of Aquatic Organisms，2004，61：75-83.

[5] VOYLES J，YOUNG S，BERGER L，et al.Pathogenesis of chytridiomycosis，a cause of catastrophic amphibian declines[J].Science，2009，326（5952）：582-585.

[6] KRIGER K M，PEREOGLOU F，HERO J.Latitudinal variation in the prevalence and intensity of chytrid （Batrachochytrium dendrobatidis） infection in eastern Australia[J].Conservation Biology，2007，21（5）：1280-1290.

[7] BERGER L，SPEARE S，HYATT A.Chytrid fungi and amphibian declines：overview，implications and future directions[M]//Declines and disappearances of Australian frogs.Canberra：Environment Australia，1999：23-33.

[8] WELDON C.Chytridiomycosis survey in south africa[J].Froglog，2002，51：1-2.

[9] GARNER T W，WALKER S，BOSCH J，et al.Chytrid fungus in Europe[J].Emerg Infect Dis，2005，11（10）：1639-1641.

[10] BOVERO S，SOTGIU G，ANGELINI C，et al.Detection of chytridiomycosis caused by Batrachochytrium dendrobatidis in the endangered Sardinian newt （Euproctus platycephalus） in southern Sardinia，Italy[J].Journal of Wildlife Diseases，2008，44（3）：712-715.

[11] UNE Y，KADEKARU S，TAMUKAI K，et al.First report of spontaneous chytridiomycosis in frogs in Asia[J].Diseases of Aquatic Organisms，2008，82（2）：157-160.

[12] MCLEOD D S，SHERIDAN J A，JIRAUNGKOORSKUL W，et al.A survey for chytrid fungus in Thai amphibians[J].The Raffles Bulletin of Zoology，2008，56（1）：199-204.

[13] BATAILLE A，F(xiàn)ONG J J，CHA M，et al.Genetic evidence for a high diversity and wide distribution of endemic strains of the pathogenic chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis in wild Asian amphibians[J].Molecular Ecology，2013，22：4196-4209.

[14] YANG H，BAEK H，SPEARE R，et al.First detection of the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis in free-ranging populations of amphibians on mainland Asia：survey in South Korea[J].Diseases of Aquatic Organisms，2009，86：9-13.

[15] BAI C，GARNER T W，LI Y.First evidence of Batrachochytrium dendrobatidis in China：discovery of chytridiomycosis in introduced American bullfrogs and native amphibians in the Yunnan Province，China[J].EcoHealth，2010，7（1）：127-134.

[16] BAI C，LIU X，F(xiàn)ISHER M C，et al.Global and endemic Asian lineages of the emerging pathogenic fungus Batrachochytrium dendrobatidis widely infect amphibians in China[J].Diversity and Distributions，2012，18（3）：307-318.

[17] 曾朝輝，白世卓，朱蘊綺，等.蟾蜍壺菌病病原遺傳分化研究[J].經(jīng)濟動物學(xué)報，2011，15（3）：160-163.

[18] 曾朝輝，白世卓，朱蘊綺，等.館藏澤蛙標(biāo)本壺菌病原實時 PCR 檢測與系統(tǒng)發(fā)育分析[J].經(jīng)濟動物學(xué)報，2012，16（3）：168-171.

[19] ANNIS S L，DASTOOR F P，ZIEL H，et al.A DNA-based assay identifies Batrachochytrium dendrobatidis in amphibians[J].Journal of Wildlife Diseases，2004，40（3）：420-428.

[20] BOYLE D，BOYLE D，OLSEN V，et al.Rapid quantitative detection of chytridiomycosis （Batrachochytrium dendrobatidis） in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay[J].Diseases of Aquatic Organisms，2004，60：141-148.

[21] MULLIS K B，ERLICH H A，GELFAND D H，et al. Reacting nucleic acid with oligonucleotide primer in presence of catalytic enzyme dna polymerase； polymerase chain reaction patent： US，4965188[P].1990-10-23.

[22] 金宇良.PCR 技術(shù)的研究進展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2012（10）：47-48.

[23] 姜莉莉，樊兆斌，高文玉.水貂綠膿桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴增快速檢測方法的建立[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28（29）：79-82.

[24] 張立軍，楊雙，阮燕曄，等.擬南芥T-DNA 插入突變體atsuc3 的PCR 鑒定[J].植物生理學(xué)通訊，2006，42（1）：91-94.

[25] MA Z，LUO Y，MICHAILIDES T.Nested PCR assays for detection of Monilinia fructicola in stone fruit orchards and Botryosphaeria dothidea from pistachios in California[J].Journal of Phytopathology，2003，151（6）：312-322.

[26] MAYER C L，PALMER C J.Evaluation of PCR，nested PCR，and fluorescent antibodies for detection of Giardia and Cryptosporidium species in wastewater[J].Applied and Environmental Microbiology，1996，62（6）：2081-2085.

[27] ANDREA T.Two dimensional optimization of a semi-nested PCR for detecting Listeria monocytogenes[J].Eppendorf Bio News Application Notes，2000，6：3-4.

[28] KHAN J，SRIVASTAVA P，SINGH S.Efficacy of nested-PCR for the detection of phytoplasma causing spike disease of sandal[J].Current Science，2004，86（11）：1530-1538.

[29] BECHER P，ORLICH M，KOSMIDOU A，et al.Genetic diversity of pestiviruses：identification of novel groups and implications for classification[J].Virology，1999，262（1）：64-71.

[30] 蘭平，李文鳳，朱水芳，等.甘薯叢枝病植原體的 PCR 檢測[J].植物學(xué)通報，2001，18（2）：210-215.

[31] GAERTNER J P，F(xiàn)ORSTNER M R，ODONNELL L，et al.Detection of Batrachochytrium dendrobatidis in endemic salamander species from Central Texas[J].Eco Health，2009，6（1）：20-26.

[32] GOKA K，YOKOYAMA J，UNE Y，et al.Amphibian chytridiomycosis in Japan：distribution，haplotypes and possible route of entry into Japan[J].Molecular Ecology，2009，18（23）：4757-4774.

[33] WHITE T J，BRUNS T，LEE S，et al.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M].San Diego，California：Academic Press，1990：315-322.

[34] HEID C A，STEVENS J，LIVAK K J，et al.Real time quantitative PCR[J].Genome Research，1996，6（10）：986-994.

[35]GINZINGER D G.Gene quantification using real-time quantitative PCR：an emerging technology hits the mainstream[J].Experimental Hematology，2002，30（6）：503-512.

[36] GARNER T W，PERKINS M W，GOVINDARAJULU P，et al.The emerging amphibian pathogen Batrachochytrium dendrobatidis globally infects introduced populations of the North American bullfrog，Rana catesbeiana[J].Biology Letters，2006，2（3）：455-459.

[37] KRIGER K M，HINES H B，HYATT A D，et al.Techniques for detecting chytridiomycosis in wild frogs：comparing histology with real-time Taqman PCR[J].Diseases of Aquatic Organisms，2006，71（2）：141-148.

[38] 鐘江華，張光萍，柳小英.實時熒光定量 PCR 技術(shù)的研究進展與應(yīng)用[J].氨基酸和生物資源，2011，33（2）：68-72.

[39] STUART S N，CHANSON J S，COX N A，et al.Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide[J].Science，2004，306（5702）：1783-1786.

[40] SHOEMAKER D，SCHADT E，ARMOUR C，et al.Experimental annotation of the human genome using microarray technology[J].Nature，2001，409（6822）：922-927.

[41] WU J，SMITH L T，PLASS C，et al.ChIP-chip comes of age for genome-wide functional analysis[J].Cancer Research，2006，66（14）：6899-6902.

[42] ROBERTS S S，MORI M，PATTEE P，et al.GABAergic system gene expression predicts clinical outcome in patients with neuroblastoma[J].Journal of Clinical Oncology，2004，22（20）：4127-4134.

[43] 賀建華，劉麗莉，謝紅兵，等.基因芯片篩選畜禽熱應(yīng)激差異表達基因的研究進展[J].動物營養(yǎng)學(xué)報，2012，24（12）：2287-2294.

[44] 陳國宏，欒德琴，常國斌，等.利用基因芯片技術(shù)研究隱性白雞不同時期肌肉組織相關(guān)差異表達基因[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2012，32（1）：83-88.

[45] HUANG J，SHENG H H，SHEN T，et al.Correlation between genomic DNA copy number alterations and transcriptional expression in hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma[J].FEBS Letters，2006，580（15）：3571-3581.

[46] 肖華勝，滕曉坤.基因芯片與高通量DNA 測序技術(shù)前景分析[J].生命科學(xué)（C輯），2008，38（10）：891-899.

[47] HARRIS T D，BUZBY P R，BABCOCK H，et al.Single-molecule DNA sequencing of a viral genome[J].Science，2008，320（5872）：106-109.

[48] SCHENA M，SHALON D，DAVIS R W，et al.Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray[J].Science，1995，270（5235）：467-470.

[49] SCHENA M，SHALON D，HELLER R，et al.Parallel human genome analysis：microarray-based expression monitoring of 1000 genes[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，1996，93（20）：10614-10619.

[50] LU Y，LEMON W，LIU P Y，et al.A gene expression signature predicts survival of patients with stage I non-small cell lung cancer[J].PLoS Medicine，2006，3（12）：2229-22431.

[51] CLARKE P A，POELE R，WORKMAN P.Gene expression microarray technologies in the development of new therapeutic agents[J].European Journal of Cancer，2004，40（17）：2560-2591.

責(zé)任編輯 宋平 責(zé)任校對 況玲玲