正交法優(yōu)化普通油茶花粉萌發(fā)的培養(yǎng)成分

黃國文　管天球　趙雨云　陳莫林　劉宏輝

摘要 [目的]研究普通油茶離體花粉的培養(yǎng)條件。[方法]以蔗糖、維生素C、H3BO4、MgSO4、培養(yǎng)液pH 為影響油茶花粉萌發(fā)的因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，研究這些成分對油茶花粉萌發(fā)的影響。[結(jié)果]油茶花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)液成分為蔗糖150 g/L，維生素C 0.02 g/L，H3BO40.15 g/L，MgSO4 0.07 g/L，培養(yǎng)基pH 6；影響油茶花粉萌發(fā)主要的因素是蔗糖，其次是H3BO4。[結(jié)論]該研究結(jié)果為油茶的有性雜交打下了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 油茶；花粉萌發(fā)；培養(yǎng)液成分；正交法

中圖分類號 S794.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）19-150-02

普通油茶（ Camellia oleifera Abel）也稱中果油茶，屬山茶科山茶屬常綠小喬木或灌木，是我國南方特有的木本食用油料樹種[1]，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。茶油營養(yǎng)豐富，不飽和脂肪酸含量高，并含有豐富的蛋白質(zhì)，維生素A、B、D、E和抗氧化物等成分，是優(yōu)質(zhì)保健油；其茶籽粕和果殼可制茶皂素、活性炭、烤膠等多種產(chǎn)品，是重要的工業(yè)原料。油茶的花苞在每年4～5月份開始形成，10～11月份開花，花兩性，異花授粉，自花授粉和風(fēng)媒傳粉率低，主要由昆蟲傳粉，上年的果實(shí)也在此時(shí)成熟。長期以來，油茶落花落果嚴(yán)重，坐果率低，導(dǎo)致大面積油茶產(chǎn)量低[2]。 花粉生活力高低影響授粉受精。離體花粉在碳源、H3BO4及礦質(zhì)元素等成分的參與下才能萌發(fā)、花粉管才能正常生長[3]。該文以普通油茶花粉為材料，研究培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)液pH對油茶離體花粉萌發(fā)的影響，為理解油茶花粉離體萌發(fā)特性和受精過程、調(diào)控油茶花粉萌發(fā)和人工輔助授粉提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料 在位于湖南科技學(xué)院周圍的西山上，于2014年12月中旬切取生長健壯的有含苞待放花蕾的普通油茶花枝，帶回實(shí)驗(yàn)室水培，收集快散落的花粉用于試驗(yàn)。

1.2 研究方法

1.2.1 花粉液體培養(yǎng)法。采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)油茶花粉。在凹槽載玻片上滴加50 μl特定液體培養(yǎng)基，用大頭針蘸取適量花粉使其均勻地撒在培養(yǎng)基上。將載玻片放入鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，放在黑暗、25 ℃恒溫箱中保濕培養(yǎng)4 h。用光學(xué)顯微鏡觀察每個(gè)玻片，隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)的視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野花粉數(shù)目不少于50個(gè)，以花粉管長度等于或大于花粉粒直徑視為萌發(fā)，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。各試驗(yàn)均重復(fù)3次。萌發(fā)率=已萌發(fā)花粉數(shù)/花粉總數(shù)×100%±SD。

1.2.2 單因素試驗(yàn)。以30 mmol/L MES（pH 7）溶液配成含有蔗糖濃度100 g/L、維生素C濃度為0.01 g/L、H3BO3濃度0.10 g/L、MgSO4濃度0.03 g/L的花粉粒萌發(fā)基本培養(yǎng)基，以基本培養(yǎng)基中缺少相應(yīng)成分的培養(yǎng)基為對照。變動其中的因素，蔗糖濃度為50、100、150、200、250 g/L，維生素C濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/L，H3BO3濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.30 g/L，MgSO4濃度為0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 g/L，培養(yǎng)基pH為4、5、6、7、8、9。研究各種成分對普通油茶花粉萌發(fā)的影響，確定適于花粉萌發(fā)的各種組分濃度。

1.2.3 正交試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對普通油茶花粉萌發(fā)影響較大的水平，以正交表L18（35）安排試驗(yàn)，確定花粉萌發(fā)培養(yǎng)基中各種組分的最佳濃度組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖濃度對油茶花粉萌發(fā)的影響 蔗糖濃度是影響油茶花粉萌發(fā)的重要因素（圖1a）。蔗糖濃度為150 g/L時(shí)萌發(fā)率最大，濃度過低或者過高萌發(fā)率降低。原因可能是蔗糖濃度調(diào)節(jié)花粉粒的滲透壓，濃度過高或過低影響花粉水分代謝，不利于花粉萌發(fā)的物質(zhì)代謝活動，因此選擇 100、150、200 g/L 3個(gè)水平作為蔗糖濃度的優(yōu)化條件。

2.2 維生素C濃度對油茶花粉萌發(fā)的影響 維生素C影響油茶花粉的萌發(fā)（圖1b）。維生素C濃度為0.02 g/L時(shí)萌發(fā)率最大，濃度過低或者過高萌發(fā)率降低。說明還原劑維生素C能夠影響油茶花粉的萌發(fā)，因此選擇0.01、0.02、0.03 g/L 3個(gè)水平作為維生素C濃度的優(yōu)化條件。

2.3 H3BO4濃度對油茶花粉萌發(fā)的影響 H3BO4影響油茶花粉的萌發(fā)（圖1c）。H3BO4濃度為0.15 g/L時(shí)萌發(fā)率最大，濃度過低或者過高萌發(fā)率降低，因此選擇0.10、0.15、0.20 g/L 3個(gè)水平作為H3BO4濃度的優(yōu)化條件。

2.4 MgSO4濃度對油茶花粉萌發(fā)的影響 鎂離子影響花粉的萌發(fā)（圖1d）。MgSO4溶液濃度為0.05 g/L 時(shí)萌發(fā)率最大，濃度過低或者過高萌發(fā)率降低；濃度為0.09 g/L時(shí)抑制了花粉萌發(fā)，因此選擇 0.03、0.05、0.07 g/L 3個(gè)水平作為MgSO4濃度的優(yōu)化條件。

2.5 培養(yǎng)基pH對油茶花粉萌發(fā)的影響 培養(yǎng)基pH影響油茶花粉的萌發(fā)（圖1e）。培養(yǎng)基pH6時(shí)萌發(fā)率最大，培養(yǎng)基pH過低或者過高萌發(fā)率降低。原因可能是適宜的pH是花粉粒正常生命活動的前提，pH影響了花粉萌發(fā)的物質(zhì)代謝和能量代謝活動，因此選擇 pH5、6、7共3個(gè)水平作為pH優(yōu)化條件。

2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)蔗糖濃度、維生素C濃度、H3BO4濃度、MgSO4濃度、培養(yǎng)液pH這5個(gè)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行正交試驗(yàn)L18（35），以普通油茶花粉萌發(fā)率為指標(biāo)，結(jié)果見表1。由極差分析可知，這5個(gè)因素對普通油茶花粉萌發(fā)的影響程度依次是蔗糖濃度、H3BO4濃度、MgSO4濃度、維生素C濃度、培養(yǎng)液pH；最優(yōu)水平組合為蔗糖150 g/L，維生素C濃度0.02 g/L，H3BO4濃度0.15 g/L，MgSO4濃度0.07 g/L，培養(yǎng)液pH6。

3 結(jié)論與討論

植物花粉萌發(fā)是一個(gè)復(fù)雜的生理過程和形態(tài)建成過程，涉及花粉管的極性生長和管壁的構(gòu)建等過程[4]，有多種成分參與花粉萌發(fā)和花粉管生長過程。蔗糖在花粉萌發(fā)中主要起到提供能源和碳源以及調(diào)節(jié)滲透壓的作用[5]。蔗糖濃度過高，導(dǎo)致花粉細(xì)胞脫水死亡。硼離子除了能夠調(diào)節(jié)花粉粒的滲透壓以外，還能與蔗糖形成絡(luò)合物，還利于花粉管壁的建造[6]；此外，硼能夠影響果膠甲酯酶活性，缺硼導(dǎo)致酸性果膠質(zhì)在頂端大量富集，造成花粉管破裂[7]。鈣離子能夠結(jié)合果膠質(zhì)聚集在花粉管壁中，能夠增強(qiáng)管壁的強(qiáng)度，促進(jìn)花粉管伸長。在沒有鈣離子的情況下需要鎂離子來促進(jìn)花粉管伸長[8]。維生素C是一種還原劑，能促進(jìn)分生組織和中柱鞘細(xì)胞從G1 期到S 期的分裂，并使不活動中心細(xì)胞數(shù)量明顯減少[9]。該文研究了培養(yǎng)基的一些成分和pH對油茶花粉萌發(fā)的影響，表明在該試驗(yàn)中影響花粉萌發(fā)最大的因素是蔗糖濃度，其次是H3BO4濃度，說明蔗糖和H3BO4是花粉萌發(fā)培養(yǎng)基的最基本成分。培養(yǎng)基的最優(yōu)水平組合為蔗糖濃度150 g/L，維生素C濃度0.02 g/L，H3BO4濃度0.15 g/L，MgSO4濃度0.07 g/L，培養(yǎng)液pH 6。

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