重組Pen—2乳桿菌的抗感染作用及其對小鼠免疫功能的影響

李林曦　倪龍泉　孟小林　王健　徐進(jìn)平

摘要 [目的]在實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建了含有對蝦抗菌肽基因Pen-2的重組乳桿菌L.casei 393/pen的基礎(chǔ)上，研究重組乳桿菌L.casei 393/pen經(jīng)口服小鼠后的抗感染和免疫促進(jìn)作用。[方法]將昆明系小鼠和balb/c系小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、乳桿菌L.casei 393組和重組乳桿菌L.casei 393/pen組，口服灌胃小鼠。每隔7 d測量小鼠體重，28 d后檢測小鼠的免疫器官指數(shù)和細(xì)胞因子IL-6的濃度，并用金黃色葡萄球菌對其進(jìn)行腹腔注射攻毒。[結(jié)果]灌胃28 d后，重組乳桿菌L.casei 393/pen組的體重、免疫器官指數(shù)和細(xì)胞因子IL-6濃度均明顯高于其他2個(gè)試驗(yàn)組；用金黃色葡萄球菌攻毒后，重組乳桿菌L.casei 393/pen組的死亡率比乳桿菌L.casei 393低50%，比生理鹽水組低83.3%。[結(jié)論]重組乳桿菌L.casei 393/pen經(jīng)口服小鼠后，具有顯著的抗金黃色葡萄球菌感染和較好的免疫促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞 干酪乳桿菌；對蝦抗菌肽Pen-2；表達(dá)載體；免疫促進(jìn)

中圖分類號(hào) S865.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）19-118-04

抗菌肽是指一類具有抗菌活性的小分子多肽。它廣泛存在于自然界中，在宿主的先天性免疫中有著重要的作用[1-3]。其中，對蝦抗菌肽Penaeidins是來源于南美白對蝦（Penaeus vannamei）的一類抗菌肽[4]，由Delphine Destoumieux 等于1997年在南美白對蝦的血淋巴中分離到。Penaeidins的分子量大小為5.48～6.62，與大多數(shù)抗菌肽類似，富含陽離子，等電點(diǎn)為9.34～9.84[5]。它具有2個(gè)富含脯氨酸或半胱氨酸的區(qū)域，C端有3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，并且需要進(jìn)行翻譯后修飾[6]。其中，Pen-2是Penaeidins家族中的一員，成熟的Pen-2分子的C端是以酰胺化的形式存在的。研究表明，Penaeidins家族抗菌肽具有廣譜抗菌活性，并且還具有與幾丁質(zhì)相連的特性，因此它能抵抗細(xì)菌和真菌，尤其是革蘭氏陽性菌[7-8]。人們通過不同的表達(dá)系統(tǒng)來重組表達(dá)Penaeidins，其中常用的表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌[9]和酵母[10-11]，但鮮少有用乳酸菌作為重組表達(dá)系統(tǒng)的。筆者以乳酸菌為表達(dá)載體，進(jìn)行Pen-2的活性探究。

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一類以糖類為碳源，發(fā)酵產(chǎn)物為乳酸的無芽孢G+菌。筆者選用的表達(dá)宿主干酪乳桿菌（L.casei）是乳酸菌中的一種，它在1971年被Hansen和Lessel選出來作為干酪乳桿菌的新模式菌株[12]，被公認(rèn)為“三大益生菌”之一。它作為食品級(jí)微生物，具有大規(guī)模發(fā)酵研究前景，與人類的生活密切相關(guān)，被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)療保健、農(nóng)業(yè)等各業(yè)[13]。干酪乳桿菌也是人類腸道和口腔內(nèi)的正常菌群，能抵抗胃酸、膽汁、具有低免疫原性，并且能夠定植于腸道，是作為口服疫苗的理想載體[14-17]。該研究中所用的干酪乳桿菌質(zhì)粒為實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建表達(dá)載體，能有效地將外源基因重組進(jìn)干酪乳桿菌中進(jìn)行表達(dá)，并將其錨定于細(xì)胞壁表面。因此，用干酪乳桿菌作為宿主表達(dá)對蝦抗菌肽Pen-2，可使Pen-2通過口服的方式進(jìn)入免疫宿主體內(nèi)，并且與干酪乳桿菌的腸道黏膜定植功能相結(jié)合，從而更好地研究Pen-2的免疫促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)別6周齡的Balb/c小鼠和6周齡的昆明小鼠，雌性，體重為（18±2）g；鼠糧，購自湖北省疾控中心的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。

1.2 菌種 重組乳桿菌L.casei 393/pen由病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；乳桿菌L.casei 393，于實(shí)驗(yàn)室-70 ℃超低溫冰箱中保存；金黃色葡萄球菌，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.3 試劑 苦味酸（用于給小鼠進(jìn)行標(biāo)記，購自武漢眾一生物有限公司）；LB培養(yǎng)基；MRS培養(yǎng)基和MRS誘導(dǎo)培養(yǎng)基（pH 6.2～6.5）；濃度為0.9%的無菌生理鹽水；小鼠細(xì)胞因子IL-6的ELISA檢測試劑盒（48孔，購自武漢百騰生物有限公司）；PBS（pH 8.0）；75%酒精。

1.4 儀器 臥式冷凍離心機(jī)，為美國sigma公司產(chǎn)品；灌胃針頭，為武漢眾一生物有限公司產(chǎn)品；1 ml無菌注射器和分析天平，為上海越平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫培養(yǎng)箱，為上海浦東躍欣儀器廠產(chǎn)品；恒溫?fù)u床，為中國科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；常溫離心機(jī)，為德國Eppendorf公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)；小鼠解刨實(shí)驗(yàn)器具。

1.5 方法

1.5.1 試驗(yàn)分組和給藥途徑。將小鼠分為口服生理鹽水對照組、乳桿菌L.casei 393組和重組乳桿菌L.casei 393/pen組。通過灌胃的方式進(jìn)行口服給藥，生理鹽水對照組灌胃生理鹽水，劑量為0.5 ml/只；乳桿菌L.casei 393組灌胃菌濃度為109 CFU/ml的乳桿菌L.casei 393生理鹽水懸濁液，劑量為0.5 ml/只；重組乳桿菌L.casei 393/pen組灌胃菌濃度為109 CFU/ml的重組乳桿菌L.casei 393/pen生理鹽水懸濁液，劑量為0.5 ml/只。

1.5.2 乳桿菌L.casei 393和重組乳桿菌L.casei 393/pen的培養(yǎng)及處理。在MRS基本培養(yǎng)基內(nèi)，分別轉(zhuǎn)接300 μl乳桿菌L.casei 393和重組乳桿菌L.casei 393/pen，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置培養(yǎng)48 h；在MRS誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)，轉(zhuǎn)接300 μl基本培養(yǎng)2 d的菌液，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)72 h；誘導(dǎo)培養(yǎng)好的菌液，在冰上處理集菌，使用冷凍離心機(jī)8 000 r/min離心5 min，棄上清培養(yǎng)基，稱菌濕重，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)值計(jì)算出菌體個(gè)數(shù)。用預(yù)冷的pH 8.0的PBS洗菌3次，冷凍離心機(jī)8 000 r/min 5 min，最后用0.9%的生理鹽水重懸，調(diào)整菌濃為1010 CFU/ml。

1.5.3 對金黃色葡萄球菌腹腔注射小鼠的保護(hù)作用。

1.5.3.1 金黃色葡萄球菌對小鼠最小致死劑量的測定。接種金黃色葡萄球菌甘油菌接種于新鮮的20 ml LB培養(yǎng)基， 37 ℃搖床，12 h過夜，用10倍稀釋法將菌液進(jìn)行稀釋，分別稀釋10-5倍、10-6倍、10-7倍，分別取各濃度的100 μl菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫箱靜置培養(yǎng)過夜。通過平板菌落計(jì)數(shù)，確定原先LB液體培養(yǎng)基12 h培養(yǎng)過夜的菌濃。選取9只小鼠，分為3組，依次按照金黃色葡萄球菌的濃度為1.2×108、1.2×109和1.2×1010 CFU/ml，進(jìn)行腹腔注射攻毒，使用1 ml注射器，每只小鼠注射0.5 ml，觀察48 h內(nèi)死亡率。

1.5.3.2 口服灌胃pDL-Pen/L.C 393工程菌對金黃色葡萄球菌腹腔注射小鼠的保護(hù)作用。對灌胃28 d的各組小鼠，在第29天腹腔注射最小致死劑量濃度的金黃色葡萄球菌：大批量培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，37 ℃過夜培養(yǎng)12 h，離心集菌后用LB培養(yǎng)基重懸，調(diào)整濃度為最小致死劑量（1.2×1010）；用腹腔注射法對3個(gè)試驗(yàn)組小鼠進(jìn)行攻毒，注射完畢后觀察無菌液有沒有外漏和注射是否成功；常規(guī)喂鼠糧和水，觀察小鼠的死亡情況。

1.5.4 對小鼠生理指標(biāo)的影響。每隔2 d對3組試驗(yàn)小鼠灌胃生理鹽水、乳桿菌L.C 393和重組乳桿菌L.casei 393/pen，每次在上午9：00進(jìn)行灌胃口服，每隔7 d測量體重，分別在第0、7、14、21、28天，空腹6 h后測量體重。

1.5.5 對小鼠外周血細(xì)胞因子IL-6的影響。用小鼠細(xì)胞因子IL-6 ELISA檢測試劑盒，對小鼠外周血細(xì)胞因子IL-6進(jìn)行檢測。用摘除眼球法取血，滅菌EP管收集血液，37 ℃水浴30 min，3 000 r/min離心10 min，吸取上層血清分裝到滅菌的150 μl EP管內(nèi)；將板條從4 ℃取出后，在室溫下平衡20 min；設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔，直接用血清作為樣品，并用記號(hào)筆進(jìn)行標(biāo)記；按照說明書步驟進(jìn)行操作，反應(yīng)的最后在每孔加入終止反應(yīng)液50 μl，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測定各孔的OD值。

1.5.6 對小鼠免疫器官的影響。連續(xù)灌胃28 d后，用頸椎脫臼法處死小鼠，造成勁椎脫臼，小鼠立即死亡。 小鼠死亡后對其進(jìn)行解剖，用消毒的鑷子和手術(shù)剪取出位于小鼠左腹部的脾臟和位于心臟的正上方的胸腺。小心剝離胸腺、脾臟和周圍組織，用吸水紙吸干脾臟和胸腺的表面水分，置于天平上稱重。根據(jù)以下公式

計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)：臟器系數(shù)=器官重量/小鼠體重。

2 結(jié)果與分析

2.1 對金黃色葡萄球菌腹腔注射小鼠的保護(hù)作用

2.1.1 最小致死劑量。分別用濃度為108、109、1010 CFU/ml的金黃色葡萄球菌腹腔注射小鼠，結(jié)果表明48 h內(nèi)1010 CFU/ml組小鼠全部死亡，而108 CFU/ml組和109 CFU/ml組的小鼠依舊存活。因此，選取1010 CFU/ml為金黃色葡萄球菌的最小致死劑量。

2.1.2 死亡率。生理鹽水組、乳桿菌L.case組、重組乳桿菌L.casei 393/pen組，分別取9只小鼠，在連續(xù)口服灌胃的28 d后，第29天用濃度為1010 CFU/ml金黃色葡萄球菌腹腔注射經(jīng)口服灌胃的3組實(shí)驗(yàn)小鼠。從圖1可以看出，生理鹽水組、乳桿菌L.casei 393組和重組乳桿菌L.casei 393/pen組試驗(yàn)小鼠的死亡率分別為100%、66.7%和16.7%。重組乳桿菌L.casei 393/pen組死亡率比乳桿菌L.C 393組降低了50%，比生理鹽水組降低了83.3%。

2.2 對小鼠生理指標(biāo)體重的影響

體重作為生理指標(biāo)之一，能在一定程度上反映機(jī)體的身體素質(zhì)，在28 d內(nèi)，每隔2 d口服灌胃小鼠，分別在第0、7、14、21、28天空腹6 h后，稱量小鼠體重。從圖2可以看出，3組小鼠的體重有顯著差異（P<0.05），說明在干酪乳桿菌的對機(jī)體益生作用的基礎(chǔ)上，重組乳桿菌L.casei 393/pen所表達(dá)的Pen-2對小鼠體重也有一定的促進(jìn)作用。

2.3 對小鼠外周血細(xì)胞因子IL-6的影響

2.3.1 細(xì)胞因子IL-6的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以不同的濃度的標(biāo)準(zhǔn)品為對象，計(jì)算出不同的IL-6濃度與OD450之間的對應(yīng)關(guān)系，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。

2.3.2 各組小鼠細(xì)胞因子IL-6濃度。分別取口服灌胃28 d后的3組小鼠的血清，與小鼠細(xì)胞因子IL-6的ELISA檢測板進(jìn)行孵育，最后檢測450 nm處的吸光值OD450 nm，將吸光值代入圖2中計(jì)算出每組小鼠細(xì)胞因子IL-6的濃度。從圖4可以看出，重組乳桿菌L.casei 393/pen組的細(xì)胞因子IL-6的濃度明顯高于乳桿菌L.casei 393組和生理鹽水組（P<0.05）。

2.4 對小鼠免疫器官的影響 解剖3組口服灌胃的試驗(yàn)小鼠，取出胸腺和脾臟器官，用吸水紙吸干稱量，計(jì)算出免疫器官指數(shù)。從圖5～6可以看出，重組乳桿菌L.casei 393/pen組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均明顯高于乳桿菌L.casei 393組和生理鹽水空白對照組（P<0.05）。

3 討論

由于在當(dāng)今的醫(yī)療中，人們對抗生素濫用的情況越來越嚴(yán)重，導(dǎo)致了很多超級(jí)細(xì)菌的產(chǎn)生，因此尋找新的抗菌藥物已成了人們關(guān)注的焦點(diǎn)。與此同時(shí)，抗菌肽——一種具有抗菌效果并且廣泛存在與自然界中的小分子多肽進(jìn)入了人們的研究范圍。抗菌肽的抗菌機(jī)理不同于抗生素，是通過在細(xì)胞膜形成離子通道，使得細(xì)菌細(xì)胞不能保持正常的滲透壓而死亡，因此它不容易使病原微生物產(chǎn)生抗藥性。另外，抗菌肽廣泛存在與自然界的各種生物中，屬于內(nèi)源性的抗生素。該研究對象Pen-2抗菌肽是首次從南美白對蝦血淋巴中分離得到的1種甲殼類抗菌肽家族中的一員。大多數(shù)的抗菌肽具有廣譜抗菌活性，不同來源的抗菌肽抗菌范圍有所不同。Pen-2抗菌肽也具有光譜抗菌活性，主要針對絲狀真菌和革蘭氏陽性菌。在這些年的研究中，人們發(fā)現(xiàn)除了抗菌活性，某些抗菌肽還具有一定的免疫調(diào)節(jié)活性：能作為免疫效應(yīng)細(xì)胞的趨化因子；能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞因子的表達(dá)；能促進(jìn)B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的增值等等。筆者以甲殼類抗菌肽Pen-2的重組乳桿菌為研究對象，探究小鼠口服攝入后的免疫調(diào)節(jié)功能。

乳酸菌作為益生菌中的主要成員，基于其為人所熟知的益生作用，被廣泛應(yīng)用于人們的生活中。乳酸菌作為外源基因表達(dá)系統(tǒng)，有以下優(yōu)點(diǎn)：本底表達(dá)量低，易于外源蛋白表達(dá)后純化；基因工程菌的構(gòu)建方法逐漸成熟，易培養(yǎng)；根據(jù)表達(dá)載體的不同，不僅可以胞內(nèi)表達(dá)、分泌表達(dá)，而且可以將外源蛋白展示于菌體表面；其誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)所用誘導(dǎo)物也均為食品級(jí)，可應(yīng)用于大規(guī)模的食品發(fā)酵工業(yè)中；安全性高，無內(nèi)毒素，可直接口服攝入體內(nèi)，大大降低了表達(dá)產(chǎn)物后的處理成本。其中，乳酸菌的可直接口服性是它相對其他表達(dá)系統(tǒng)的巨大優(yōu)勢，口服攝入可以方便大范圍攝入，避免了靜脈注射而導(dǎo)致感染的危險(xiǎn)，并且口服免疫產(chǎn)生的抗體大部分都分泌到消化系統(tǒng)，使得很多致病微生物不能通過宿主機(jī)體的的黏膜表面進(jìn)入身體組織。干酪乳桿菌也是乳酸菌中的一種，是公認(rèn)的三大益生菌之一，廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵工業(yè)中。筆者以干酪乳桿菌作為表達(dá)宿主，不僅可以直接口服給藥大大簡化Pen-2的表達(dá)后純化工作，而且干酪乳桿菌能夠耐受機(jī)體的防御機(jī)制（如胃酸、膽汁等），并長期定植于腸道內(nèi)，持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)Pen-2基因，這能使我們更好地研究Pen-2的長期作用效果。

筆者對小鼠進(jìn)行口服灌胃重組乳桿菌L.casei 393/pen組，并設(shè)置乳桿菌L.C 393對照組和生理鹽水空白對照組，從生理指標(biāo)、免疫器官指數(shù)、細(xì)胞因子的促進(jìn)作用及其對金葡菌攻毒的保護(hù)作用等方面研究了重組乳桿菌L.casei 393/pen對小鼠的免疫調(diào)節(jié)功能的影響。在口服灌胃28 d后，對比生理鹽水對照組，重組乳桿菌L.casei 393/pen能明顯促進(jìn)小鼠的體重增長、脾臟細(xì)胞和胸腺細(xì)胞的增值以及促進(jìn)細(xì)胞因子IL-6的分泌（P<0.05）。此外，乳桿菌L.casei 393相對于生理鹽水組也有一定的差異，這可能是因?yàn)楦衫胰闂U菌是三大益生菌之一，對機(jī)體的免疫功能也有一定的促進(jìn)作用。在金葡菌的攻毒試驗(yàn)中，生理鹽水組的小鼠全部在24 h內(nèi)死亡，乳桿菌L.casei 393的小鼠有66.7%在48 h內(nèi)陸續(xù)死亡，另有33.3%的小鼠存活下來，而重組乳桿菌L.casei 393/pen，只有16.7%的小鼠死亡，并且是在48～72 h內(nèi)死亡的，其余83.3%的小鼠均存活下來。雖然重組乳桿菌L.casei 393/pen也有一定的死亡率，但是從死亡時(shí)間上來看重組乳桿菌L.casei 393/pen也可以起到攻毒后延緩死亡的作用。雖然乳桿菌L.casei 393組還有33.3%存活，但遠(yuǎn)不如重組乳桿菌L.casei 393/pen組小鼠的存活率，說明雖然干酪乳桿菌有一定的益生作用，但重組乳桿菌L.casei 393/pen較乳桿菌L.casei 393有更為明顯的保護(hù)作用。

雖然該試驗(yàn)結(jié)果還不足以完全證實(shí)，還需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行完善，但是從生理指標(biāo)、免疫器官指數(shù)、細(xì)胞因子的促進(jìn)作用以及對金葡菌攻毒的保護(hù)作用等方面可以看出，小鼠口服重組乳桿菌L.casei 393/pen后其對小鼠的免疫功能是具有一定的增強(qiáng)作用。該試驗(yàn)結(jié)果對口服抗菌肽基因工程乳酸菌藥物的研制有一定的參考價(jià)值。

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