辣椒疫霉多聚半乳糖醛酸酶活性對其致病力的影響

李萍　張茜茹　吳亞　高智謀

摘要 [目的]研究安徽省辣椒疫霉（Phytophthora capsici Leonian）的致病力與多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性的關系。[方法]采用平板法定性檢測辣椒疫霉產生的果膠酶活性，并對不同致病力菌株的PG活性的變化進行分析。[結果]辣椒疫霉均可產生果膠酶，形成水解圈。供試菌株接種辣椒苗復壯后的PG活性高于復壯前；強致病力菌株的PG活性明顯高于弱致病力菌株；供試菌株的PG活性均在培養(yǎng)后第7天達到峰值。[結論]PG活性的高低與辣椒疫霉菌致病力的強弱相關，是該菌的致病相關酶。

關鍵詞 辣椒疫霉；多聚半乳糖醛酸酶；致病力

中圖分類號 S436.418.1+9 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）19-111-03

由辣椒疫霉引起的辣椒疫病是一種世界毀滅性病害[1]，現(xiàn)該病廣泛分布于北京、上海、湖南、安徽、甘肅、新疆、陜西、青海、內蒙古、遼寧、吉林、山東、云南、臺灣、湖北、海南等地，尤以江蘇、浙江、安徽、上海等長江中下游地區(qū)發(fā)生嚴重[2-6]，已成為我國辣椒生產的嚴重障礙[7]。

植物病原真菌病菌分泌的酶主要包括幾種果膠降解酶，如果膠甲基酯酶（PME）、果膠裂解酶（PL）和PG[8-9]。關于果膠酶對真菌致病性中的作用已有報道[10]，人們對果膠酶對病原真菌的作用的相關研究進行了總結，但迄今的數(shù)據(jù)幾乎只認定致病性是數(shù)量性狀[11-12]。而Have等[11]還認為真菌細胞壁降解酶在致病性上的作用與真菌的生活史相關。Reignault等[13]認為果膠酶不但能決定植物被入侵的程度，而且可以決定病害癥狀的特征。人們調查了大量病害的植物病原菌果膠酶與致病性的相關性，得到了很大進展，但關于辣椒疫霉致病性與果膠酶的相關性研究很少。

PG是一種細胞壁結合蛋白，催化裂解果膠分子聚半乳糖醛酸，降解果膠，使細胞壁結構解體，從而導致果實的軟化。PG不僅與果實成熟、葉和花的脫落、豆莢開裂、花粉成熟、病原物防御以及植物寄主的互作有關，還與細胞伸長、發(fā)育和木質化有關。病原菌侵染寄主植物時首先分泌的細胞壁降解酶是PG，因此，PG的研究受到了廣泛關注并取得了一定的成果。研究發(fā)現(xiàn)PG是許多植物病原卵菌的關鍵致病因子，在病原菌與寄主的相互作用中起重要作用[14]。孫文秀[15]從蛋白水平上研究了大豆疫霉根腐病菌的PG活性對致病力的影響，結果表明，該菌能分泌PG，大豆疫霉根腐病菌的PG活性高低與致病力強弱有一定的相關性。筆者在前期試驗的基礎上，研究了PG活性對辣椒疫霉致病性的影響，旨在為進一步從分子水平上探討辣椒疫霉菌的致病遺傳機制和防治辣椒疫病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。

56個辣椒疫霉菌株用于果膠酶定性測定；選取強致病性菌株FY2、FY2′（將菌株FY2接種辣椒苗復壯后重新分離獲得）和弱致病性菌株HX2用于PG活性的測定。

1.1.2 培養(yǎng)基。

胡蘿卜培養(yǎng)基（CA）：將200.00 g新鮮胡蘿卜切成小片，加去離子水500.0 ml，煮沸后計時30 min，用雙層紗布過濾去渣，補水至1 000.0 ml，加入瓊脂20.00 g，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

Czapek-Dox固體培養(yǎng)基：KNO3 2.00 g，KCl 0.50 g，F(xiàn)eSO4 0.01 g，K2HPO4 1.00 g，MgSO4 0.50 g，維生素B1 0.20 g，L-天冬酰胺0.50 g，柑橘果膠10.00 g，瓊脂粉20.00 g，蒸餾水1 000.0 ml。

Czapek-Dox液體培養(yǎng)基：KNO3 2.00 g，KCl 0.50 g，F(xiàn)eSO4 0.01 g，K2HPO4 1.00 g，MgSO4 0.50 g，維生素B1 0.20 g，L-天冬酰胺0.50 g，柑橘果膠10.00 g，蒸餾水1 000.0 ml。

1.2 方法

1.2.1 果膠酶定性測定。

辣椒疫霉菌株在CA平板上25 ℃、黑暗中生長3 d后，用打孔器沿菌落邊緣打直徑為7 mm的菌碟，接種于初篩培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)2 d后，加入2.0 ml 0.2%剛果紅染色液，靜止染色10 min，然后倒出染色液，加生理鹽水漂洗。對于有水解圈現(xiàn)象的平板，測量水解圈直徑（D）和菌落直徑（d），并計算D/d值。通過比較D/d值來判斷菌株的產果膠酶的能力。

1.2.2 辣椒疫霉PG粗酶液的制備。

將在CA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d的辣椒疫霉菌株接到Czapek-Dox液體培養(yǎng)基中，每瓶5個菌碟，每個菌株各培養(yǎng)3瓶，28 ℃下100 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔24 h取樣一次，每次每瓶吸取1 ml，連續(xù)取樣14 d，樣品在4 ℃下5 000 r/min離心30 min，取上清液供PG活性測定。

1.2.3 辣椒疫霉PG活性的測定。

采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法。將1.00 g DNS溶于20.0 ml 1.00 mol/L氫氧化鈉溶液中，加入50.0 ml蒸餾水、30.00 g酒石酸鉀鈉，溶解后用蒸餾水稀釋至100.0 ml，密封。取1.8 ml 0.1%多聚半乳糖醛酸溶液，加100 μl酶液、100 μl 0.05 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液，30 ℃水浴1 h。反應后取0.2 ml反應液與0.2 ml DNS試劑混合，沸水浴10 min。然后取出用雙蒸水稀釋至3.0 ml，用分光光度計測定OD540，以煮沸的培養(yǎng)基濾液作為對照。PG酶活力單位定義為：在上述條件下，1 min酶液分解果膠生成1 μmol半乳糖醛酸所需的酶量為1個酶活單位（U）。

2 結果與分析

2.1 強致病力和弱致病力辣椒疫霉菌產果膠酶的比較 在Czapek-Dox固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2 d的辣椒疫霉菌用剛果紅染色，生理鹽水漂洗后，產果膠酶的菌株會有明顯的水解圈（圖1）。結果表明，所有供試的辣椒疫霉菌株均能產生果膠酶，各個菌株形成水解圈的直徑不同，其中，菌株FY2′經(jīng)剛果紅染色后的水解圈直徑最大，達56.3 mm（表1）。1.10≤D/d≤1.50的菌株共26個，占

總菌株數(shù)的46.4%；1.51≤D/d≤2.00的菌株共28個，占總菌株數(shù)的50.0%；2.01≤D/d≤2.15的菌株共2個，占總菌株數(shù)的3.6%。水解圈直徑和菌落直徑的比值反映各菌株產果膠酶能力的大小，比值越大，產果膠酶的能力越強。與前期的致病力測定結果比較，發(fā)現(xiàn)產酶能力的大小與菌株的致病力存在一定的相關性，菌株HX2對辣椒對致病力較弱，產生的水解圈不明顯；菌株FY2的致病力較強，產生了明顯的水解圈，且菌株FY2′的致病力強于FY2。部分菌株雖然致病力弱，但形成了明顯的水解圈，可能原因是產生的果膠酶不是主要作用于PG。選取致病力強且水解圈明顯的菌株FY2、復壯后的菌株FY2′以及致病力弱且水解圈不明顯的菌株HX2，測定PG的活性。

2.2 辣椒疫霉不同致病性菌株的PG活性大小

2.2.1 辣椒疫霉致病菌株接種前后PG活性的比較。

測定菌株FY2以及FY2接種辣椒重新分離得到的菌株FY2′的PG活性。由圖2可知，供試菌株在含柑橘果膠的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，均產生較高的胞外PG活性。其中，F(xiàn)Y2′的PG活性高于FY2，且均在第7天達到最高值，表明辣椒疫霉菌株接種復壯前后的PG活性存在差異，復壯后菌株PG活性高于復壯前菌株，表明PG與辣椒疫霉的致病力存在一定的相關性。

2.2.2 辣椒疫霉強致病性菌株和弱致病性菌株PG活性的比較。

由圖3可知，2種菌株均能分泌胞外PG，且強致病性菌株的PG活性高于弱致病性菌株，并同時于第7天達到酶活高峰。因此，PG是辣椒疫霉菌與致病力相關的一種細胞壁降解酶。

3 討論

植物病原菌侵染寄主植物是一個復雜過程，在侵入過程中首先遇到表皮角質層的障礙，然后遇到細胞壁屏障。因此，寄主與病原物建立寄生關系時，病原菌分泌的酶可以分解寄主的角質層和細胞壁等，使植物發(fā)病。其中，果膠酶是主要的細胞壁降解酶，作用于細胞壁的中膠層。而PG是果膠水解酶之一，多數(shù)病原物與寄主互作過程中都會產生一定量的PG，導致細胞壁結構解體和組織軟化。由于病原菌侵染寄主植物首先分泌的細胞壁降解酶為PG，因此，PG的研究已受到廣泛關注。

國外已有關于疫霉pg基因簇的研究報道，并發(fā)現(xiàn)多聚半乳糖醛酸酶是許多卵菌的致病關鍵因子[16]。Torto等[17]從馬鈴薯晚疫病菌（P.infestans）分離得到卵菌的第1個endo-PG 基因pipg1，為卵菌的進化研究邁出了關鍵的一步，研究發(fā)現(xiàn)該基因在P.infestans侵染寄主前期和侵染過程中會大量表達；同時，基因pipg1編碼的內切多聚半乳糖醛酸酶具有致病活性，且該基因在卵菌的進化中起著重要作用。PG的致病性由單個或多個基因共同調控，當灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的1個內切型PG基因有效表達，會加重番茄果實

發(fā)病[18]；當腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）的1個內切PG基

因受到抑制，致病性就會喪失[19]；隱球叢赤殼菌（Cryphonectria parasitica）的Enpg-1基因發(fā)生突變，對致病性無明顯影響[20]；鏈格孢菌（Alternaria citri）的1個內切型PG基因發(fā)生突變，會減輕柑橘果實發(fā)病[21]。

目前，研究者不斷優(yōu)化培養(yǎng)條件，探索最佳的產酶條件，以便更好地確定防治病害的最佳時機。Maldonado等[22]研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉在以葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中，30 ℃下300 r/min 培養(yǎng) 72 h，結果在24 h時PG活性達到最高，并且該菌在固體和液體培養(yǎng)基上均能產生PG，該酶的活性與葡萄糖濃度成反比。Charlone等[23]研究發(fā)現(xiàn)Ca2+濃度對灰葡萄孢所分泌的2種PG的活性都能產生部分的抑制作用。該研究從蛋白質水平上研究了辣椒疫霉的PG活性對致病力的影響，結果表明辣椒疫霉能夠分泌PG，PG活性隨病菌培養(yǎng)時間的增加酶活性增加，在第7天達最高值，之后酶活性呈下降趨勢。證實了PG是該菌的與致病作用相關的細胞壁降解酶，初步闡明了辣椒疫霉菌致病機理。為更好地防治辣椒疫病，明確辣椒疫霉菌PG致病的分子機制，還有待于從基因水平對關鍵致病基因進行進一步探索。

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