聚乙二醇單甲醚接枝殼聚糖取代度測定方法與分析

楊心督 張其清

殼聚糖是甲殼素脫乙酰基的產(chǎn)物，也是生物界唯一的一種堿性多糖。殼聚糖分子中還有多個(gè)乙酰己糖胺殘基，在分子間能夠形成氫鍵，導(dǎo)致殼聚糖不溶于水和其他有機(jī)溶劑，限制了其應(yīng)用范圍。聚乙二醇能夠增加賦予材料新的特性和功能，如親水性，柔性以及抗巨噬細(xì)胞吞噬等性能。近年來，國內(nèi)外對聚乙二醇改性殼聚糖衍生物的研究相當(dāng)廣泛，目前主要應(yīng)用于納米藥物載體［1］、基因治療［2］以及溫敏性凝膠［3］等領(lǐng)域的研究和開發(fā)。我們已報(bào)道采用甲醛連接法合成了聚乙二醇接枝殼聚糖材料，但目前對聚乙二醇單甲醚接枝殼聚糖的取代度測定方法較多，原理各異，鮮有文獻(xiàn)對不同測定方法進(jìn)行研究。為測定聚乙二醇接枝殼聚糖的取代程度，本研究對相關(guān)測定方法進(jìn)行了探討和分析，報(bào)道如下。

1 儀器及樣品

核磁共振譜儀(500 MHz，VARINA INOVA)，聚乙二醇單甲醚接枝殼聚糖(實(shí)驗(yàn)室自制)，聚乙烯醇硫酸鉀(PVSK，上海紫一試劑廠)，甲苯胺藍(lán)(sigma 公司)，其它試劑為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

通過改變聚乙二醇單甲醚與殼聚糖投料比化學(xué)合成三種不同取代程度的聚乙二醇單甲醚接枝殼聚糖樣品。分別采用膠體滴定法和核磁共振譜法對三批樣品進(jìn)行取代程度測定，對結(jié)果進(jìn)行匯總分析。

2.1 膠體滴定測定法 將已經(jīng)干燥恒重的聚乙二醇單甲醚接枝殼聚糖樣品溶于25 ml 去離子水，配制成0.02%的樣品溶液，準(zhǔn)確量取5 ml 置于錐形瓶，加入0.2 mol/L 的鹽酸溶液2 ml 和甲苯胺藍(lán)指示劑一滴，搖勻，采用已標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)聚乙烯醇硫酸鉀溶液進(jìn)行滴定，以溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)榱磷仙珵榈味ńK點(diǎn)，并進(jìn)行空白對照。按照以下公式計(jì)算聚乙二醇單甲醚接枝殼聚糖的氨基含量(NH2%)。

其中:CN 為標(biāo)定的聚乙烯醇硫酸鉀的濃度(mmol/L);M 為殼聚糖鏈節(jié)相對分子質(zhì)量;C 為樣品溶液的濃度(g/ml);V 為滴定體積(ml);V0 為空白滴定體積(ml)。

采用上述方法，同時(shí)測定殼聚糖的氨基含量(NH2%)，并進(jìn)行空白對照。按照以下公式計(jì)算聚乙二醇單甲醚接枝殼聚糖的取代度(DS)。

DS = 聚乙二醇單甲醚接枝殼聚糖氨基含量(NH2%)-殼聚糖氨基含量(NH2%)。

2.2 核磁共振譜法 采用VARINA INOVA 500 MHz型核磁共振儀，以D2O/CH3COOD 為溶劑，測定接枝殼聚糖的核磁共振圖譜。

圖1 聚乙二醇單甲醚接枝殼聚糖核磁共振譜

如圖1 顯示，δ2.90為殼聚糖2 位氫信號，δ3.22為聚乙二醇單甲醚中甲氧基氫信號，采用δ2.90與δ3.2的峰面積比值來計(jì)算得到聚乙二醇單甲醚接枝殼聚糖的取代度。

其中:DS 為聚乙二醇單甲醚接枝殼聚糖的取代度，I3.22ppm和I2.90ppm為δ2.90和δ3.22的峰面積。

3 測定結(jié)果

通過膠體滴定法和核磁共振譜法對不同取代度的聚乙二醇單甲醚接枝殼聚糖均可測定，其中，膠體滴定法屬于間接方法，核磁共振譜法屬于直接方法。見表1。

表1 聚乙二醇單甲醚接枝殼聚糖取代度測定結(jié)果表

兩種不同方法測定結(jié)果進(jìn)行比較，膠體滴定法和核磁共振法測定的取代程度數(shù)值存有差異，但從取代程度的趨勢上看，隨著投料比例的增加，取代度逐漸增大。見圖2。

圖2 不同方法測定聚乙二醇單甲醚接枝殼聚糖取代度情況圖

4 討論

高分子多糖通常是多種不同分子量多糖的集合，分子量分布比較寬泛，分子的鏈長也存在較大差異，難以將分子量及鏈節(jié)的取代程度進(jìn)行精確測定，一般淶水，高分子的分子量及鏈節(jié)的取代程度的測定值均為平均值。聚乙二醇接枝殼聚糖是一種改性的高分子多糖，目前，對聚乙二醇接枝殼聚糖的取代度的測定方法眾說紛紜，常用方法主要包括稱重法、元素分析法、紅外光譜法、膠體滴定法以及核磁共振譜法等，稱重法、元素分析法以及紅外光譜法對樣品的需求量大，一般要求較高，每種方法都存在一定的局限性。

本研究通過采用膠體滴定法和核磁共振譜法分別測定了聚乙二醇接枝殼聚糖的取代度，比較分析了兩種方法測定結(jié)果的差異。從測定結(jié)果看，兩種測定方法隨著投料比不斷增加，取代度不斷增大的趨勢基本一致，但測定數(shù)值存有差異，造成差異的原因主要包括以下兩個(gè)方面:一是測定數(shù)值的含義不同，核磁共振法測定的聚乙二醇單甲醚的取代程度為摩爾百分含量，膠體滴定法測定的取代程度為質(zhì)量百分含量;二是測定原理有所不同，膠體滴定法是對帶電基團(tuán)進(jìn)行容量分析，以指示劑顏色變化作為指示終點(diǎn)，測定過程及結(jié)果容易受到pH 值、濃度、滴定速度和離子強(qiáng)度等影響［4］。此外，由于膠體滴定法測定時(shí)需要對殼聚糖和聚乙二醇接枝殼聚糖進(jìn)行同時(shí)測定后才能計(jì)算聚乙二醇?xì)ぞ厶堑娜〈潭?，屬于間接測定方法。當(dāng)聚乙二醇單甲醚與殼聚糖的取代度較高時(shí)，由于聚乙二醇單甲醚具有親水性、柔性，聚乙二醇單甲醚會(huì)對聚乙烯醇硫酸鉀產(chǎn)生分子位阻，在氨基葡萄糖周圍形成保護(hù)云，使得聚乙烯醇硫酸鉀難以及時(shí)與殼聚糖氨基的正電荷發(fā)生反應(yīng)，而提前與甲苯胺藍(lán)反應(yīng)，導(dǎo)致指示終點(diǎn)提前，因此，采用膠體滴定測定時(shí)，對取代度高的樣品采用該方法對測定結(jié)果影響較大。定量核磁共振譜法測定原理主要是利用聚乙二醇單甲醚的甲氧基和殼聚糖氨基葡萄糖上的氫的積分面積比值來確定取代程度，只需測定聚乙二醇單甲醚接枝殼聚糖樣品即可，屬于直接測定方法，但由于殼聚糖氨基葡萄糖單元上氫的核磁共振的強(qiáng)度較弱，聚乙二醇單甲醚甲氧基的化學(xué)位移和殼聚糖2 位氨基的化學(xué)位移在核磁共振譜中比較接近，測定時(shí)需對兩者實(shí)現(xiàn)有效分離，并且圖譜容易分辨，對儀器和樣品的要求都高。此外，聚乙二醇單甲醚的取代度較高時(shí)，其甲氧基的核磁共振信號更強(qiáng)，而殼聚糖氨基葡萄糖單元上氫的核磁共振強(qiáng)度較弱，通過兩者的積分面積比值計(jì)算取代程度可能會(huì)造成測定結(jié)果偏高。此外，由于在樣品的合成過程中需要不斷調(diào)整反應(yīng)條件，需要在合成過程中監(jiān)測樣品的取代程度，而核磁共振譜法對樣品要求也較高，核磁共振儀器設(shè)備較為昂貴，給樣品檢測帶來了不便，采用膠體滴定法測定方法相對簡單，合成過程中可隨時(shí)監(jiān)測，比較適用于合成過程中樣品取代度的檢測。綜合以上分析，兩種測定方法各有優(yōu)劣，必要時(shí)可通過兩種方法測定后進(jìn)行驗(yàn)證，以防止出現(xiàn)偏倚。

1 Li HL，He YX，Gao QH，et al.Folatepolyethylene glycol conjugated carboxymethyl chitosan for tumortargeted delivery of 5fluorouracil Molecular Medicine Reports，2014，9:786-792.

2 Meenakshi M，Tomaro-Duchesneau C，Saha S，et al.Development and characterization of chitosan-PEG-TAT nanoparticles for the intracellular delivery of siRNA International Journal of Nanomedicine，2013，8:2041-2052

3 Termsarasab D，In-Soo Y，Ju-Hwan P，et al.Polyethylene glycol-modified arachidyl chitosan-based nanoparticles for prolonged blood circulation of doxorubicin International Journal of Pharmaceutics，2014，464 :127-134.

4 Mocchiutti P，Zanuttini MA.Key considerations in the determination of polyelectrolyte concentration by the colloidal titration method.Bioresources，2007，2:399-407.