扶正舒肝顆粒的制備及質(zhì)量標準研究

饒雙超 程麗娟 萬富貴

慢性乙型肝炎是嚴重危害人民健康的一種常見傳染病，目前我國約有慢性肝炎患者有2 300 萬，盡管采用了各種治療手段，但很多問題無根本性突破。扶正舒肝顆粒的處方來源于我院肝病科多年應用的協(xié)定方，具有扶正祛邪，舒肝解毒，散瘀止痛的功能，主治慢性乙型肝炎屬久病正氣不足，肝郁血瘀，癥見頭暈乏力，脅肋脹痛，舌質(zhì)淡或暗，脈弦。經(jīng)在我院臨床應用觀察表明，本品能顯著改善患者的臨床癥狀，并且觀察到大部分患者HBV-DNA 病毒數(shù)量顯著下降，其中三例乙肝病毒復制患者病毒轉(zhuǎn)陰。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 赤芍藥300 g、葉下珠300 g、苦參300 g、丹參300 g、炙黃芪300 g、靈芝200 g、甘草100 g共制成顆粒1 000 g。

1.2 方法 利用多功能提取器水煮醇沉的方法提取分離，采用正交試驗確定最佳提取工藝參數(shù)，薄層色譜法鑒別苦參，HPLC 法測定芍藥苷含量。

2 結(jié)果

2.1 制備

2.1.1 加水煎煮時提取參數(shù)的確定:由于本處方中藥材的活性成分水溶性較好，能夠用水提醇沉法進行提取分離［1］。經(jīng)預試驗考察水煮時間、次數(shù)及加水量三因素，按處方量藥材，置多功能提取器內(nèi)，照正交表安排試驗。將煎煮液合并、濾過、濾液濃縮至相對密度約1.1(50 ～60℃)，加入70%量的乙醇，靜置過夜，取上清液回收乙醇后濃縮至相對密度約1.3(50 ～60℃)的稠膏，烘干，稱重。按藥典2010 年版白芍藥材中芍藥苷的含量測定方法，測定干膏中芍藥苷(C23H28O11)的含量，將干膏中芍藥苷(C23H28O11)的含量乘以干膏總量得提取芍藥苷的總量，再除以計劃顆粒量1 000得到每克顆粒中芍藥苷的含量，并對此數(shù)據(jù)進行考核。

2.1.2 水煮因素水平表 見表1。

表1 因素水平表

2.1.3 正交試驗:根據(jù)因素水平，選擇L9(34)表，去掉第3 列安排試驗，以干膏重量和芍藥苷含量為考核指標。以干膏量為考核指標時，A、B、C 三因素均能影響，其出膏量以A2B3C3 為最佳組合。仔細分析因素B 時，分別發(fā)現(xiàn)煮2 次和3 次只隔2.0，平均每次只相差0.67(g)，可知在此條件下，水煮2 次和水煮3 次幾差別微小。以芍藥苷含量為考核指標時，最佳組合為A3B2C3，同A2 和A3 差別不大，(6.832 －6.577)/3 =0.085(mg)。綜合以上三個因素的試驗結(jié)果，從確保制劑質(zhì)量和節(jié)約資源綜合分析，確定最佳工藝條件為A2B2C3，即第1 次1.5 h 第2 次1 h，共煮2 次，每次用水為12 倍量。見表2。

表2 L9(34)正交試驗安排及數(shù)據(jù)表

2.1.4 中試研究:為驗證工藝的可行性，以處方量的10 倍中試了三批。見表3。

表3 中試研究

2.1.5 根據(jù)以上試驗結(jié)果確定制備工藝為 按處方稱取經(jīng)檢驗合格的藥材飲片，置多功能提取器內(nèi)，加水(12 倍藥材重量)，第1 次煎煮1.5 h，第2 次煎煮1 h。將煎液合并、濾過、濾液濃縮至相對密度約1.1(50 ～60℃)，加70%量的乙醇，靜置過夜，取上清液回收乙醇，濃縮至相對密度1.3(50 ～60℃)的稠膏。將稠膏:糊精:甜菊甙(2∶10∶0.12)混勻，以75%乙醇為濕潤劑和粘合劑，制粒，干燥，整粒，包裝。

2.2 質(zhì)量標準

2.2.1 性狀:本品為棕黃色或黃褐色的顆粒;氣微香，味甜、微苦。

2.2.2 檢查:應符合中國藥典2010 年版一部附錄IC顆粒劑項下各項有關(guān)規(guī)定。

2.2.3 鑒別:取本品10 g，研細，加氯仿20 ml 與氨水5 ml，超聲處理25 min，過濾后將濾液蒸干，用1 ml 氯仿溶解殘渣，作為供試液。按供試液的方法，制備無苦參的陰性對照液。另取氧化苦參堿標準品，用乙醇溶解制成0.5 mg/ml 的溶液作為標準對照液。吸取供試液、標準對照、液陰性對照液各2 μl，分別點于同一用2%NaOH 溶液制備的硅膠G 薄層板上，以正丁醇:乙酸乙酯:氨水(4∶5∶1)展開，晾干后噴稀碘化鉍鉀溶液。供試液色譜中，在與標準對照液相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾［2，3］。見圖1。

2.2.4 含量測定［4，5］:照高效液相色譜法(2010 年版中國藥典一部附錄VI)

2.2.4.1 儀器與試劑:LC-10TvpLC-10T 高效液相色譜儀，Clarify 色譜工作站，F(xiàn)S-1200N 型超聲處理器(1200W，20KHZ;上海生析超聲儀器有限公司);ZORBAX Eclipse XDB-C18 色譜柱，柱效以芍藥苷計均不小于4 000;乙腈試劑為色譜純，二次重蒸餾水，其余試劑均為分析純。芍藥苷(中國藥品生物制品檢定所，批號為130736-201327)。

2.2.4.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗:用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;乙腈:水(13∶87)為流動相，檢測波長為230 nm;理論板數(shù)按芍藥苷計算應不低于4 000。

圖1 苦參薄層色譜鑒別

2.2.4.3 供試液制備:取適量的扶正舒肝顆粒，研細，精密稱定0.2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 ml，密塞，稱定重量，超聲處理(1 200 W，20 kHz)25 min，用稀乙醇補足減失的重量，放冷后，離心，將上清液用微孔濾膜過濾，即得。

2.2.4.4 陰性對照液制備:按供試液制備方法，制備無赤芍藥材的陰性對照液。

2.2.4.5 標準對照液制備:精密稱取用P2O5減壓干燥12 h 后的芍藥苷標準品適量，以稀乙醇制成10 μg/ml的溶液。

2.2.4.6 測定法:分別精密吸取供試液、標準對照液、陰性對照液各20 μl，注入液相色譜儀，測定。見圖2。

圖2 芍藥苷標準曲線圖

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密稱定芍藥苷標準品適量加稀乙醇溶解制成50.150 μg/ml 對照液，并精密吸取1、4、8、13、16、20 μl 分別進樣，按色譜條件測定，以峰面積對進樣濃度進行線性回歸，得回歸方程為:Y =741389.9X+369.3(r =0.9997)。結(jié)果表明:芍藥苷在0.050 ～1.002 μg 的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見表4、圖3。

表4 線性關(guān)系考察

圖3 樣品HPLC 圖譜

2.2.6 精密度試驗:精密吸取對照液16 μl，按色譜條件連續(xù)進樣5 次，結(jié)果表明該方法的精密度良好，相對標準偏差為0.08%。見表5。

表5 精密度試驗

2.2.7 穩(wěn)定性試驗:將同一批樣品(批號140208)溶液室溫避光保存，每隔2 h 測定1 次峰面積。結(jié)果表明:樣品溶液在24 h 穩(wěn)定性良好，相對標準偏差為0.24%。見表6。

表6 穩(wěn)定性試驗

2.2.8 重現(xiàn)性試驗:取同一批樣品(批號140208)5份，進行含量測定。結(jié)果表明本方法的重現(xiàn)性較好，相對標準偏差為0.44%。見表7。

表7 重現(xiàn)性試驗

2.2.9 加樣回收試驗:按含量測定法，先測定樣品中芍藥苷含量，然后在樣品中定量加入芍藥苷，再測定芍藥苷總量，計算回收率，結(jié)果平均回收率為98.89%，相對標準偏差為1.36%。見表8。

表8 加樣回收試驗

3 討論

在本制劑處方中苦參為臣藥，主要含有生物堿類、黃酮類，其他還含有皂苷類、醌類等。在質(zhì)量標準研究中，采用苦參對照藥材作為對照，經(jīng)過多批樣品的試驗表明:采用苦參對照藥材作為對照來鑒別樣品中苦參的方法穩(wěn)定可靠，且苦參陰性樣品無干擾，故在質(zhì)量標準中采用苦參對照藥材作為對照;另外，經(jīng)過試驗表明:采用氯仿提取苦參的效果較好，陰性樣品無干擾，重現(xiàn)性考察較好。在開始的研究中，以正丁醇-無水乙醇-氨水(5∶2∶2)為展開劑展開，取出晾干后，噴稀碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與標準對照品相應的位置上，顯相同顏色斑點，但是Rf 值太大，后將展開劑改為正丁醇-乙酸乙酯-氨水(4∶5∶1)，結(jié)果比較理想。

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