膀胱尿路上皮癌中TGF-β1 和DPC4 的表達(dá)及臨床意義

楊濤 李燕 李巖 劉俊江 孫福振 王剛

膀胱腫瘤是在泌尿系統(tǒng)中最為常見的惡性腫瘤，多發(fā)生在老年人，病死率很高，其中膀胱尿路上皮癌是最為常見的病理類型，容易浸潤、進(jìn)展、復(fù)發(fā)，目前不可治愈，并且病因不明確。除了環(huán)境因素、化學(xué)因素外，膀胱腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展同時也涉及到了復(fù)雜的分子遺傳學(xué)因素，包括染色體核型的異常、基因突變、表觀遺傳學(xué)的改變等。為能更早期的發(fā)現(xiàn)、診斷、治療，并防止其進(jìn)展，有很多問題有待解決。近來我們發(fā)現(xiàn)膀胱尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展與某些基因的表達(dá)異常及一些信號通路異常有關(guān)系，如Wnt/β-catenin 通路、Notch通路等的異常激活。目前認(rèn)為若腫瘤細(xì)胞喪失了對于TGF-β 的生長抑制的敏感性，極有可能會導(dǎo)致腫瘤的浸潤以及轉(zhuǎn)移，抵制抗腫瘤的免疫反應(yīng)。它在腫瘤細(xì)胞中的浸潤和轉(zhuǎn)移方面可能發(fā)揮重要的作用。并且發(fā)現(xiàn)TGF-β 與多種信號通路異常有關(guān)。DPC4 基因主要是能夠作為保守序列SMADs 蛋白家族中，并且能夠直接參與轉(zhuǎn)化TGF-β 在實際的細(xì)胞內(nèi)部中進(jìn)行信號傳導(dǎo)的相關(guān)功能，并且在TGF-β 的超家族的信號傳導(dǎo)過程中是出于中樞地位的，并且有研究表明DPC4 基因的失活以及缺失始于一些腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著較大的關(guān)系。如何更有效防止惡性腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移，防止腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并延長患者的生存期將成為焦點問題。我院使用免疫組織化學(xué)法討論TGF-β1 以及DPC4 與膀胱移行細(xì)胞癌之間的關(guān)系，說明了膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)過程分子生物學(xué)相關(guān)機制，取得了較好的效果，有助于膀胱尿路上皮癌的診斷，為膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展提供理論依據(jù)，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院在2013 年5 月至2014 年5月收集的膀胱尿路上皮癌存檔蠟塊共50 例，其中男38 例，女12 例;通過相關(guān)病理學(xué)證實，所有存檔蠟塊均為膀胱尿路上皮癌，年齡35 ～68 歲，平均年齡(50.13 ±1.26)歲。同時需要手機5 例膀胱尿路上皮癌的癌旁組織，所有的癌旁組織距離腫瘤邊緣3 ～5 cm，并且所有標(biāo)本均未經(jīng)過HE 染色，通過對WHO尿路腫瘤組織學(xué)分類的相關(guān)使用，我們發(fā)現(xiàn)所有存檔蠟塊中的浸潤性尿路上皮癌共31 例、非浸潤性乳頭狀尿路上皮癌19 例，其中高級別15 例，低級別4 例。其中未經(jīng)過化療治療的初發(fā)腫瘤29 例，經(jīng)過化療后的復(fù)發(fā)腫瘤為21 例。

1.2 治療方法 在本次研究中，需要使用免疫組織化學(xué)S-P 法對膀胱尿路上皮癌的50 例存檔蠟塊以及5例癌旁組織中的TGF-β1 和DPC4 表達(dá)水平。首先需要對所有的標(biāo)本進(jìn)行一般方式下的取材，同時取材完成后需要進(jìn)行固定脫水以及包埋和切片的相關(guān)處理，在處理完成后需要進(jìn)行HE 染色和封片的處理。在本次研究中我們選擇兔抗人TGF-β1 多克隆抗體以及即用型的兔抗人DPC4 多克隆抗體。同時也需要使用超敏即用型的SP 通用型的免疫組織化學(xué)試劑以及DAB顯色試劑盒以及聚賴氨酸，也需要準(zhǔn)備好在實際的免疫組織化學(xué)法中需要檢測出的TGF-β1 和DPC4 相關(guān)抗原。第一步是需要將5 μm 組織切片進(jìn)行常規(guī)處理即脫蠟脫水的相關(guān)處理，并且需要在0.01 mmol/L PBS 中進(jìn)行3 ×3 min 進(jìn)行抗原修復(fù)，并在室溫情況下進(jìn)行冷卻后，需要在0.01 mmol/L PBS 中進(jìn)行漂洗5 ×3 min，并需要進(jìn)行3%的過氧化氫進(jìn)行滴入，在滴入完成后，在37℃的環(huán)境下孵育10 min，甩去多余的血清，再分別滴入一抗，在4℃的環(huán)境下進(jìn)行孵育過夜，在0.01 mmol/L PBS 中進(jìn)行3 ×5 min 的漂洗，并且滴入二抗，在37℃的環(huán)境下進(jìn)行10 min 的孵育，在0.01 mmol/L PBS 中進(jìn)行3 ×3 min的漂洗，并需要滴入新鮮的DAB 顯色液進(jìn)行顯色，使用光鏡下進(jìn)行反應(yīng)時間的控制，并需要使用蘇木素進(jìn)行復(fù)染，隨后使用流水沖洗，并使用0.1%的氨水進(jìn)行返藍(lán)處理，對標(biāo)本進(jìn)行封片以及鏡檢。在鏡檢完成后需要使用HPIAS-1000 對TGF-β1 和DPC4 的表達(dá)進(jìn)行觀察和定量分析，計算陽性反應(yīng)面積、平均光密度以細(xì)胞總面積，最后需要對陽性面積率進(jìn)行計算。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用PSS 17.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以± s 表示，采用t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1 在膀胱尿路上皮癌與癌旁組織中的表達(dá)情況 通過本次研究我們使用了免疫組織化學(xué)法的方式進(jìn)行了研究。在本次研究完成后我們發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在膀胱尿路上皮癌組織中呈現(xiàn)出高表達(dá)的情況，在正常的癌旁組織中呈現(xiàn)出一種低表達(dá)的情況，在患者的膀胱尿路上皮癌中的平均光密度為0.2542 ±0.0068，陽性面積率為0.2678±0.0061，但在患者的癌旁組織中的平均光密度為差異為0.0358±0.0012 陽性面積率為0.0488±0.0018，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.2 DPC4 在膀胱尿路上皮癌與癌旁組織中的表達(dá)情況 同時DPC4 在膀胱尿路上皮癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)情況，在癌旁組織中呈現(xiàn)高表達(dá)情況，在患者的膀胱尿路上皮癌中的平均光密度為0.0586 ±0.0052，陽性面積率為0.0625 ±0.0053。但在患者的癌旁組織中的平均光密度為0.3129 ± 0.0078，陽性面積率為0.3192 ±0.0073，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見表1、2。

表1 膀胱尿路上皮癌以及癌旁組織中TGF-β1 的平均光密度以及陽性面積率 ± s

表1 膀胱尿路上皮癌以及癌旁組織中TGF-β1 的平均光密度以及陽性面積率 ± s

組別 平均光密度 陽性面積率膀胱尿路上皮癌(n =50)0.2542 ±0.0068 0.2678 ±0.0061癌旁組織(n =5) 0.0358 ±0.0012 0.0488 ±0.0018 t 值71.1248 79.324 P 值0.0000 0.0000

表2 膀胱尿路上皮癌以及癌旁組織中DPC4 的平均光密度以及陽性面積率 ± s

表2 膀胱尿路上皮癌以及癌旁組織中DPC4 的平均光密度以及陽性面積率 ± s

組別 平均光密度 陽性面積率膀胱尿路上皮癌(n =50)0.0586 ±0.0052 0.0625 ±0.0053癌旁組織(n =5) 0.3129 ±0.0078 0.3192 ±0.0073 t 值99.668 99.9339 P 值0.0000 0.0000

3 討論

膀胱腫瘤是發(fā)生于膀胱黏膜上的一種惡性腫瘤，它是是泌尿系統(tǒng)中非常常見的一種惡性腫瘤，占到我國泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率的首位。研究表明，膀胱癌可以發(fā)生在任何年齡段，也可以發(fā)生在兒童。并且膀胱腫瘤的發(fā)病率是隨著年齡的增長而增加，據(jù)統(tǒng)計膀胱腫瘤的高發(fā)年齡在50 ～70 歲，同時發(fā)現(xiàn)男性的膀胱腫瘤的發(fā)病率是女性膀胱腫瘤的4 倍。膀胱腫瘤中最常見的事來自于尿路上皮，它的發(fā)生發(fā)展是通過各種基因的參與，同時在多種細(xì)胞因子的調(diào)控下的復(fù)雜過程，而且腫瘤細(xì)胞的浸潤及轉(zhuǎn)移往往是膀胱腫瘤中最為致命的因素。因此可以看出研究膀胱腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，浸潤的分子機制有很重要的實際意義和臨床價值。膀胱尿路上皮癌是泌尿系統(tǒng)中最為常見的一大類疾病，由于膀胱尿路上皮癌的特點，在實際的發(fā)病過程中，死亡率較高，同時目前膀胱尿路上皮癌的發(fā)病率以及死亡率也呈現(xiàn)出一種上升的趨勢，此病的侵襲性較強，可較早發(fā)生轉(zhuǎn)移，這可能與吸煙、環(huán)境污染以及職業(yè)等因素有關(guān)，但確切的病因目前仍然在進(jìn)一步的探索。所以若能夠發(fā)現(xiàn)膀胱尿路上皮癌的發(fā)病機制及分子作用機理，可能為疾病的預(yù)防及防止其進(jìn)展而奠定理論基礎(chǔ)。

在實際的對膀胱尿路上皮癌進(jìn)行研究的過程中，Liu 等［4］研究顯示轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)以及這種因子的相關(guān)家族成員對患者組織內(nèi)環(huán)境的中樞相關(guān)作用能夠起到較大的作用，在實際的使用過程中能夠?qū)⒒颊叩募?xì)胞死亡、凋亡以及生長進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)節(jié)，同時也可以將患者的細(xì)胞外基質(zhì)的合成以及分化進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)節(jié)，是一種在組織內(nèi)部環(huán)境和發(fā)育過程中能夠有著中樞作用的多功能因子，在使用的相關(guān)過程中有著調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的相關(guān)功能，同時也有著細(xì)胞外合成以及細(xì)胞分化相關(guān)的不同生物學(xué)功能，同時TGF-β 的最重要的生物學(xué)功能就是對上皮細(xì)胞產(chǎn)生抑制，若腫瘤細(xì)胞喪失了對于TGF-β的生長抑制的敏感性，極有可能會導(dǎo)致腫瘤的浸潤以及轉(zhuǎn)移，抵制抗腫瘤的免疫反應(yīng)。近年來TGF-β 的功能作用逐漸被認(rèn)識，它不僅可以促進(jìn)惡性腫瘤的血管增生、浸潤、轉(zhuǎn)移、免疫抑制等作用。TGF-β 還可以激活周細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞增生和分化，對于DPC4基因而言，最為主要的功能是作為序列保守SMADs 蛋白家族中的一員，能夠在轉(zhuǎn)化因子TGF-β 的相關(guān)細(xì)胞內(nèi)部信號的實際傳導(dǎo)過程中起著較為重要的作用，同時在實際的TGF-β 超導(dǎo)體家族中的信號傳導(dǎo)是一種中樞的相關(guān)地位，并且在以往有研究表明DPC4 基因的缺失以及失活等情況也與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著較大的關(guān)系。到目前為止，在上皮細(xì)胞癌的細(xì)胞所發(fā)揮其功能作用的研究過程中，己經(jīng)逐步闡明TGF-β 通路、SDF-1/CXCR4 通路、FGF 通路、Notch 通路、Wnt/β-catenin 通路等眾多條分子信號通路與上皮癌細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展之間的過程關(guān)系緊密，有部分研究表明wnt5a 與膀胱尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。其中在這些通路中，以TGF-β 分子信號通路最為研究對象，研究的比較多。TGF-β 是一類二聚體多肽，主要表達(dá)于在內(nèi)皮細(xì)胞、血細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞和上皮細(xì)胞中。TGF-β 同時也是一種生長因子，具被調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)功能。近年的研究表明，TGF-β 還具有刺激惡性腫瘤血管的增生、侵襲、轉(zhuǎn)移，并對宿主細(xì)胞有免疫抑制作用，以及促使腫瘤細(xì)胞增殖等多種作用。TGF-β 在惡性腫瘤血管生成中的的調(diào)控作用，主要影響血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，同時TGF-β作為一種很強的的趨化因子，可以吸引巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，并且釋放bFGF、PDGF、TNFα 等多種血管活性因子。除此之外，TGF-β 還可以促使新生血管的生成，并進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。

DPC4 是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，研究表明與胃腸道腫瘤的發(fā)病關(guān)系密切，但最近發(fā)現(xiàn)DPC4 與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及其作用密切關(guān)聯(lián)。DPC4 基因是定位在人的染色體的18q21.1，由552 個氨基酸組成，其中有11 個外顯子，10 個內(nèi)含子。它的cDNA 全長是由1656 堿基組成。DPC4 蛋白是TGF-β 信號中細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)的重要元素之一。TGF-β 可以誘導(dǎo)細(xì)胞的生長抑制作用，使細(xì)胞明顯增殖從而形成腫瘤。另外研究發(fā)現(xiàn)，DPC4 基因的突變可以使Smad4 蛋白結(jié)合的活性喪失，從而使其通路中的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控失活而發(fā)生異常，造成腫瘤的形成。

在本次研究中，我們利用了免疫組織SP 法對患者的膀胱尿路上皮癌中的TGF-β1 和DPC4 的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)的檢測，通過這種方式就能夠了解到TGF-β1 和DPC4 在實際的膀胱尿路上皮癌發(fā)生以及發(fā)展過程中的相關(guān)關(guān)系。在本次研究中我們可以發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 在膀胱尿路上皮癌組織中是一種高表達(dá)的情況，但在患者正常的癌旁組織中為低表達(dá)，并且二者有顯著差異，有統(tǒng)計學(xué)意義，對于DPC4 而言，在癌旁組織中呈現(xiàn)出高表達(dá)，但在膀胱尿路上皮癌組織中呈現(xiàn)出低表達(dá)。二者有顯著差異，并有統(tǒng)計學(xué)意義。通過進(jìn)一步的分析我們發(fā)現(xiàn)，這極有可能會由于DPC4 發(fā)生基因的突變或缺失會阻斷TGF-β1，從而抑制腫瘤生長的相關(guān)通路。但這種作用會發(fā)生相關(guān)的負(fù)反饋作用，因此會導(dǎo)致細(xì)胞分泌的TGF-β1 發(fā)生提升，而通過TGF-β1 和DPC4 共同調(diào)節(jié)的形式可能會影響到惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，為今后的早期治療干預(yù)及預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。

Schwarte-Waldhoff 等［7］研 究 顯 示，TGF-β1 和DPC4 是TGF-β 在實際的傳導(dǎo)過程中起著關(guān)鍵作用的相關(guān)因子，TGF-β1 在膀胱尿路上皮癌中表達(dá)程強陽性，在癌旁組織中表達(dá)較弱，它的平均光密度及陽性表達(dá)率與癌旁組織比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。DPC4 在膀胱尿路上皮癌中表達(dá)較弱，在癌旁組織中的表達(dá)程強陽性，它的平均光密度及陽性表達(dá)率與癌旁組織比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。通過DPC4 的低表達(dá)以及TGF-β1 的高表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)能夠作為膀胱尿路上皮癌早期治療過程中的重要因素，同時我們也能夠發(fā)現(xiàn)，DPC4 在TGF-β1 的信號傳導(dǎo)過程中有著極為關(guān)鍵的作用，DPC4 的缺失或是突變極有可能會對TGF-β1 的生長抑制發(fā)生耐受，從而導(dǎo)致膀胱尿路上皮癌的發(fā)展。同時通過Lin 等［10］研究顯示，DPC4 在膀胱尿路上皮癌中的低表達(dá)，也能夠說明TGF-β1 抑制腫瘤生長的相關(guān)傳導(dǎo)通路被阻斷，而通過阻斷的相關(guān)作用，在實際的轉(zhuǎn)錄過程中得到較好的體現(xiàn)。由此可見，DPC4 的低表達(dá)以及TGF-β1 的高表達(dá)都極有可能會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸發(fā)生，但其機制需要進(jìn)一步探討。

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