致白內障基因Hsf4b K65R位點突變對下游熱休克蛋白表達的影響*

婁　強，謝盼盼，崔秀坤，馬遠方，胡延忠(河南大學醫(yī)學院醫(yī)學與分子免疫學實驗室，抗體藥物河南省工程實驗室，河南開封475004)

致白內障基因Hsf4b K65R位點突變
對下游熱休克蛋白表達的影響*

婁強，謝盼盼，崔秀坤，馬遠方，胡延忠△
(河南大學醫(yī)學院醫(yī)學與分子免疫學實驗室，抗體藥物河南省工程實驗室，河南開封475004)

［摘要］目的:探討致白內障基因熱休克因子4b(Hsf4b) K65R位點突變對其調控下游熱休克蛋白(HSP)表達的影響。方法:采用KOD-Plus-Mutagenesis-Kit試劑盒構建pWZL-blast-HA-Hsf4b/K65R賴氨酸突變質粒;通過慢病毒感染小鼠晶狀體上皮細胞mLEC構建穩(wěn)定表達Hsf4b/K65R突變質粒的細胞株; Western blotting檢測Hsf4b 在mLEC K65R點突變細胞株和野生株中的表達; Western blotting及real-timePCR檢測K65R點突變后下游蛋白Hsp70、Hsp90、Hsp27和CryAB表達的變化。結果:陽性克隆PCR及基因測序證明慢病毒載體pWZL-blast-HAHsf4b/K65R構建成功。K65R點突變后不影響Hsf4b在小鼠晶狀體上皮細胞mLEC中的表達，但能影響下游蛋白CryAB、Hsp27、Hsp70i和Hsp90a的表達。結論: pWZL-blast-HA-Hsf4b/K65R載體可用于慢病毒感染穩(wěn)定細胞株構建。Hsf4b K65R位點突變能顯著影響其對熱休克蛋白的調控功能。

［關鍵詞］熱休克因子4b;晶狀體上皮細胞;熱休克蛋白;點突變

先天性白內障是導致兒童失明的主要原因，其主要病理改變?yōu)榫铙w發(fā)育遲緩、晶狀體內非透明瘢塊組織形成。熱休克因子4b(heat shock factor 4b，Hsf4b)主要在晶狀體內表達，是調控新生兒期晶狀體發(fā)育的關鍵轉錄因子，其通過調控熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)和晶狀體蛋白的表達影響新生期晶狀體上皮細胞的增生和纖維細胞分化［1］。正常情況下，Hsf4蛋白在胚胎E13.5晶狀體組織內開始表達，在新生兒期達到高峰，隨著晶狀體成熟而逐漸減少［2］。敲除小鼠Hsf4基因能使晶狀體在新生期發(fā)育受阻，晶狀體呈現(xiàn)非透明狀白內障［3］。在晶狀體發(fā)育過程中，Hsf4b賴氨酸位點易被類泛素化、乙酰化和泛素化修飾，從而調控Hsf4b轉錄活性和蛋白穩(wěn)定性［4-5］。Hsf4 DNA結合域密碼錯義突變(如L115P、I87V、A20D、R120C和R74H)與家族常染色體顯性遺傳性白內障的發(fā)生密切相關［6-7］。Hsf4b DNA結合域錯義突變與人和動物遺傳性白內障的發(fā)生密切相關［8-10］。然而，Hsf4b DNA結合域賴氨酸位點如何影響其對熱休克蛋白的調控仍不清楚。

在本研究中，在前期構建Hsf4－/－小鼠晶狀體永生化上皮細胞系的基礎上［11］，采用定點突變技術將Hsf4b DNA結合域第65位賴氨酸位點錯義突變?yōu)榫彼?，研究Hsf4b對熱休克蛋白表達的調控，進而為研究第65位賴氨酸點的修飾在晶狀體發(fā)育過程中的調控提供基礎。

材料和方法

1菌種、細胞、載體來源

DH5α大腸桿菌本實驗室保存; 293T細胞、小鼠晶狀體上皮細胞mLEC細胞來自本實驗室; PWZL-blast-HA-Hsf4b真核表達載體由本實驗室保存。

2主要方法

2.1PWZL-blast-Hsf4b/S15A突變質粒的構建使用KOD-Plus-Mutagenesis-Kit試劑盒(Toyobo)構建點突變表達質粒;由上海生工生物工程公司設計引物，K65R的上游引物為5’-CTGCCCCAGTATTTCCGCCATAGCAACATGGCG-3’，下游引物為5’-CGCCATGTTGCTATGGCGGAAATACTGGGGCAG-3’，其中字體加粗部分為突變后堿基。以pWZL-blast-HA-Hsf4b為模板，使用導入了突變的引物進行反向PCR;在PCR產(chǎn)物中添加限制酶Dpn I，消化質粒模板(Dpn I只有在識別位點(GATC)中的腺嘌呤被甲基化后才會對其進行切斷。由于用一般的Dam甲基(+ )的大腸桿菌(JM109、DH5α等)制備的質粒已被甲基化，因而會被Dpn I切斷;直鏈狀的質粒PCR產(chǎn)物通過自連接環(huán)化以后，用于轉化大腸桿菌DH5α，取得突變導入克隆。

2.2Hsf4b野生型和Hsf4b/K65R突變型表達細胞株的篩選及建立將PWZL-blast-Hsf4b質粒和PWZL-blast-Hsf4b/S15A質粒分別與慢病毒包裝質粒pLECO共轉染293T細胞，48 h后收集細胞培養(yǎng)液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，慢病毒感染小鼠晶狀體上皮細胞(mLEC/Hsf4b－/－)，同時加入2 mg/L的polybrane，48 h后換液，在含有4 mg/L blasticidin的 DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，然后在含有2 mg/L blasticidin的DMEM培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)，至此已成功構建并篩選到穩(wěn)定株mLEC/Hsf4b和mLEC/Hsf4b/K65R。

2.3Western blotting分析K65位氨基酸突變對Hsf4b下游蛋白表達的影響mLEC/Hsf4b、mLEC/Hsf4b－/－、mLEC/Hsf4b/K65R細胞分別經(jīng)PBS洗3次，加細胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L氯化鈉，1% NP-40和蛋白水解酶抑制劑)冰上裂解30 min。10 000×g離心10 min，棄沉淀，分別取上清液與SDS上樣緩沖液混勻，100℃煮沸10 min。用10% SDS-PAGE分離，分離的蛋白質轉移到PVDF膜上，5 %脫脂奶封閉1 h，I抗［CryAB，1∶200，Santa Cruz; Hsp70i，1∶1 000，CST; Hsp90a，1∶1 000，CST; Hsp27，1∶500，Sigma;β-actin，1∶5 000，Sigma; HA-Tag (6E2)，1∶2 000，CST］于4℃孵育過夜，PBS洗去未結合的I抗，辣根過氧化物酶標記的II抗于37℃孵育1 h，隨后用PBST洗膜，洗膜后用ECL化學發(fā)光法檢測信號。

2.4Real-time PCR實驗采用TRIzol試劑(Invitrogen)分離純化各組細胞的總RNA，分光光度法測定計算提取的總RNA含量及濃度。參照cDNA Synthesis Kit和Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad)實驗操作說明進行PCR，采用Step One Plus real-time PCR system，總反應體積20.0 μL，其中2×Universal SYBR Green Supermix 10.0 μL，cDNA 0.1 μg，引物0.5 μmol/L。PCR擴增條件為: 95℃15 s，60°C 1 min，35～40個循環(huán)。所用引物由上海吉凱基因技術有限公司根據(jù)設計合成，見表1。

表1　實時熒光定量PCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for real-time PCR

3統(tǒng)計學處理

用GraphPad Prism 6.0軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用Student t-test分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 Hsf4b蛋白結構域生物信息學分析

Hsf4b全長1 482 kb，編碼493個氨基酸，含有5個重要的結構域，見圖1。其中DNA結合結構域在調控下游蛋白表達上發(fā)揮重要作用。從BLASTW的分析結果來看，該DNA結合結構域高度保守，與其它物種的基因同源性很高，見圖2。

Figure 1.Structural domain analysis of human Hsf4b protein (GI: 5921135) (http://smart.embl-heidelberg.de/and http://cplm.biocuckoo.org/).The K65R mutation site and the S299 phosphoserine site were directed by arrow heads.圖1人Hsf4b蛋白結構域分析

2 Hsf4b/K65R的測序結果比對

在本研究中，采用KOD-Plus-Mutagenesis-Kit試劑盒將DNA結合結構域的賴氨酸位點突變?yōu)榫彼?。圖3顯示了Hsf4b突變后的測序比對結果。

3 Western blotting分析K65R位點突變后Hsf4b及下游蛋白的表達

已有報道CryAB基因錯義突變能顯著降低分子伴侶活性，在應激狀態(tài)下，蛋白質聚集沉淀，能夠導致白內障［12］。熱休克蛋白Hsp27、Hsp70和Hsp90在生理和應激情況下的晶狀體上皮細胞中均有表達［13-14］。本文推測，Hsf4b可能通過調控晶狀體上皮細胞內熱休克蛋白家族成員的表達來調控細胞的生物學功能。本室的前期工作［15］已報道，Hsp27和CryAB是Hsf4b的直接下游靶點。用免疫印跡法測定了CryAB和Hsp27蛋白在mLEC/Hsf4b/K65R、mLEC/Hsf4b－/－及mLEC/Hsf4b細胞內的表達。結果顯示，HA-Hsf4b在重建的mLEC/HA-Hsf4b細胞中穩(wěn)定表達，并上調CryAB和Hsp27蛋白的表達、下調Hsp70i和Hsp90a的表達(圖4)，結果說明構建細胞株成功。進而發(fā)現(xiàn)，CryAB和Hsp27蛋白在mLEC/HSF4b細胞中的表達水平明顯高于它在mLEC/Hsf4b/K65R細胞中的表達，而Hsp70i和Hsp90a的表達降低。

Figure 4.The images of Western blotting showed the effects of Hsf4b overexpression and Hsf4b/K65R site-mutagenisis on the expression levels of CryAB，Hsp27，Hsp70i and Hsp90a in mLEC.圖4 Western blotting檢測Hsf4b及Hsf4b/K65R突變的表達對人晶狀體上皮細胞中CryAB、Hsp27、Hsp70i及Hsp90a表達的影響

4 Real-time PCR分析Hsf4b K65R位點突變后熱休克蛋白的轉錄水平

CryAB和Hsp27基因在mLEC/Hsf4b細胞中較未轉染Hsf4b的mLEC細胞表達明顯增加，Hsp70表達明顯下降，有顯著差異，而Hsp90表達沒有明顯變化，見圖5。mLEC/Hsf4b/K65R細胞組與mLEC/Hsf4b細胞組相比，CryAB、Hsp27表達明顯減少，Hsp70的表達明顯增加。

Figure 5.The mRNA expression of CryAB，Hsp27，Hsp90a，and Hsp70i in mLEC/Hsf4b/K65R　(K65R)，mLEC/Hsf4b－/－(Hsf4b－/－)，and mLEC/Hsf4b cells (Hsf4b) determined by real-time PCR.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs Hsf4b－/－;#P＜0.05 vs Hsf4b.圖5 CryAB、Hsp27、Hsp90a和Hsp70i的mRNA在K65R，Hsf4b－/－和Hsf4b細胞中的表達

討論

DNA結合結構域在用于轉錄因子的生物學功能研究中起到重要作用。人Hsf4b的DNA結合結構域在進化上高度保守，顯示其可能參與基本的與下游蛋白結合與調控功能; Hsf4b第65位賴氨酸是乙?；揎椀奈稽c，與蛋白質發(fā)揮作用密切相關。在本研究中采用了KOD-Plus-高保真性的Inverse PCR法的位點特異性突變導入試劑盒進行K65R基因定點突變。Inverse PCR法以質粒為模板，使用反向引物進行PCR，對質粒全長進行擴增，整個過程包括轉化在內只需3個步驟，比較簡便。通過采用KOD -plus聚合酶及降低PCR循環(huán)數(shù)，使可能來自PCR錯誤的2nd-site mutation(目的突變以外的突變)的可能性降到最低，可以獲得最大的突變導入率。

小鼠晶狀體上皮細胞mLEC來源于新生6 d的Hsf4－/－小鼠晶狀體前囊膜，在培養(yǎng)皿中經(jīng)含有10%胎牛血清和青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)成單層后即傳代，然后用猴腎病毒(SV40)大T-抗原轉染mLEC細胞，G418篩選建立永生化細胞系mLEC/Hsf4－/－。因此本研究中小鼠晶狀體上皮細胞mLEC沒有Hsf4b的內源性表達。

Hsf4是熱休克轉錄因子家族成員之一，在機體內有Hsf4a和Hsf4b 2種亞型。它們來源于同一個基因的不同mRNA剪輯過程。Hsf4a和Hsf4b因結構不同造成其轉錄活性相反。Hsf4a為轉錄抑制子，而Hsf4b則為轉錄激活子。Hsf4b感受外界環(huán)境刺激(比如細胞老化、加熱、紫外線照射、糖皮質激素刺激等)后，形成3聚體后和熱休克元件(HSE)結合，調控下游Hsp27、αB晶狀體蛋白、Hsp70、Hsp90的表達［6，16］，這些蛋白質對維持晶狀體的正常結構和功能具有重要的調控作用，并可調節(jié)晶狀體上皮細胞的生長［17-18］。在本研究中，Hsf4b在RNA及蛋白水平上正向調控小分子量熱休克蛋白Hsp27及CryAB的表達，負向調控熱休克蛋白Hsp70的表達，但并不顯著影響Hsp90的表達。Hsf4b的K65R位點突變能夠回復下游熱休克蛋白的表達，即HSP27和Cry-AB表達降低，而HSP70表達增加，提示Hsf4b的第65位賴氨酸位點在調控熱休克蛋白的表達中發(fā)揮重要作用，進而可能與白內障的發(fā)生密切相關。在本研究中構建的K65R突變穩(wěn)定細胞株，可以用來進一步分析Hsf4b對下游蛋白的調控機理，深入認識其在導致白內障中發(fā)揮的作用。

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(責任編輯:陳妙玲，余小慧)

Eeffect of K65R site-mutagenesis of cataracts-related gene Hsf4b on downstream heat shock proteins expression

LOU Qiang，XIE Pan-pan，CUI Xiu-kun，MA Yuan-fang，HU Yan-zhong
(Antibody Drug Engineering Laboratory of Henan Province，Medical and Molecular Immunology Laboratory，Medical School of Henan University，Kaifeng 475004，China.E-mail: hyz@henu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To clarify the impact of heart shock factor 4b (Hsf4b) K65R mutation on the regulation of downstream protein expression.METHODS: Non-functional Lys mutant plasmid pWZL-blast-HA-Hsf4b/K65R was generated by replacing single，homologous amino acids using KOD-Plus-Mutagenesis-Kit.Mouse lens epithelial mLEC stable cell lines expressing Hsf4b or Hsf4b/K65R were constructed by lentivirus infection.The expression of Hsf4b in the mutant and the wildtype mLEC cells was confirmed by Western blotting.The expression of Hsf4b downstream proteins such as heat shock protein (Hsp) 70，Hsp90，Hsp27 and CryAB was examined by Western blotting and real-time PCR.RESULTS: The results of PCR and DNA sequencing confirmed the successful construction of mLEC Hsf4b/K65R mutant.The K65R mutation didn’t influence Hsf4b expression in the mLEC cells.After K65R mutation in Hsf4b，the expression levels of Hsp27 and CryAB were down-regulated and the expression of Hsp70i and Hsp90a upregulated.CONCLUSION: pWZL-blast-HA-Hsf4b/K65R can be used to construct a stable cell line by infecting with lentivirus.Hsf4b/K65R mutation influences the regulation of downstream heat shock proteins.

［KEY WORDS］Heat shock factor 4b; Lens epithelial cells; Heat shock proteins; Site-mutagenesis

通訊作者△Tel: 0371-23885036; E-mail: hyz@henu.edu.cn

*［基金項目］國家自然科學基金資助項目(No.U1404826) ;河南省教育廳項目(No.14B310015) ;河南大學基本科研業(yè)務費科研專項(青年科研人才種子基金)

［收稿日期］2015-03-25［修回日期］2015-05-15

［文章編號］1000-4718(2015)09-1699-05

［中圖分類號］R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.030