2型糖尿病大鼠早期血清cTnI水平與心功能的變化*

尹茂山，許淑紅，牟艷玲(濟南大學、山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，山東濟南5000;山東省醫(yī)學科學院藥物研究所，山東濟南5006;中國藥科大學，江蘇南京98)

2型糖尿病大鼠早期血清cTnI水平與心功能的變化*

尹茂山1，2，許淑紅3，牟艷玲2△
(1濟南大學、山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，山東濟南250200;2山東省醫(yī)學科學院藥物研究所，山東濟南250062;3中國藥科大學，江蘇南京211198)

［摘要］目的:研究2型糖尿病大鼠早期血清心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的水平及心功能變化，探討早期2型糖尿病大鼠血清cTnI水平與糖尿病心肌損傷發(fā)生發(fā)展之間的關系，明確cTnI在糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展中的作用。方法:通過高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型，實驗將大鼠分為正常對照組、糖尿病2周模型組及4周模型組，超聲心動圖檢測心功能相關指標，血清檢測空腹血糖(FBG)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、空腹胰島素(FINS)及cTnI水平，HE染色法觀察心肌病理結(jié)構(gòu)變化，Western blot法檢測心肌cTnI蛋白表達變化，通過上述指標變化分析2型糖尿病大鼠早期血清cTnI與大鼠心功能改變之間的關系。結(jié)果:與正常組比較，2型糖尿病大鼠TC、TG、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低;糖尿病大鼠4周模型組與2周模型組相比較，TC、TG、LDL-C水平升高更明顯，HDL-C水平降低更顯著(P＜0.01) ;顯微鏡下糖尿病組大鼠心肌可見局灶性心肌細胞變性、壞死;糖尿病組大鼠相對于正常對照組血清及心肌cTnI表達顯著增加(P＜0.01)，且4周模型組比2周模型組增加更明顯。結(jié)論:糖尿病大鼠早期即出現(xiàn)cTnI水平升高和心功能改變，有望為糖尿病心肌病的早期診斷和治療提供理論依據(jù)。

［關鍵詞］心肌肌鈣蛋白I;心功能; 2型糖尿病;心肌損傷

隨著人們生活水平的提高以及肥胖發(fā)生率的增加，糖尿病(diabetes mellitus，DM)的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢，心血管并發(fā)癥是DM患者死亡的主要原因。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)最早于1972年由Rubler等提出［1］，目前，其作為糖尿病獨立的并發(fā)癥逐漸被肯定，并被臨床醫(yī)生所重視。糖尿病心肌病的診斷和治療的研究也在日益深入，其中，對于血清學相關指標在本病診斷價值中的研究也越來越多。心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)作為心肌收縮的調(diào)節(jié)蛋白，其在心肌疾病診斷中的研究價值相對較高。對于早期糖尿病患者體內(nèi)cTnI的變化情況研究較少，本文擬通過對早期2型糖尿病大鼠模型心功能變化及cTnI表達變化的規(guī)律的研究，為糖尿病心肌病的預防、早期診斷及治療提供理論基礎。

材料和方法

1實驗動物及模型建立

健康雄性SD大鼠30只，SPF級，體重150～180 g，購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實驗動物中心。大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，按體重均衡的原則隨機分為正常對照組10只，糖尿病模型組20只。對照組始終飼以普通飲食，模型組采用高脂流質(zhì)(豬油30%，膽固醇2.5%，脫氧膽酸鈉1%，常規(guī)飼料66.5%)灌胃，2組動物均自由飲水。5周后，模型組大鼠禁食12 h，頸靜脈竇取血檢測血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)等生化指標，確定形成高脂模型，誘導出大鼠胰島素抵抗(insulin resistance，IR)狀態(tài)，聯(lián)合鏈脲佐菌素造模。模型組大鼠一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素(30 mg/kg; pH 4.5檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液，4℃配制，現(xiàn)用現(xiàn)配)，對照組正常大鼠注射同體積檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液。造模后72 h尾靜脈采血檢測空腹血糖值(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，以FBG≥11.1 mmol/L、胰島素敏感指數(shù)降低為糖尿病大鼠模型建立成功。造模成功大鼠隨機分為2周模型組和4周模型組，繼續(xù)高脂飲食灌胃。對照組繼續(xù)以常規(guī)飼料喂養(yǎng)4周。

2材料與試劑

鏈脲佐菌素和戊巴比妥鈉(Sigma) ;血糖試紙(強生中國醫(yī)療器材有限公司) ; TG試劑盒、TC試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)試劑盒和高密度脂蛋白膽固醇(highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C)試劑盒(四川邁克生物科技股份有限公司) ;胰島素(insulin，INS)試劑盒、cTnI試劑盒(Lengton) ;醫(yī)用超聲耦合劑(上海申風醫(yī)療保健有限公司)。

3實驗方法

3.1空腹血糖及胰島素檢測高脂灌胃5周后，大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素后72 h，禁食12 h，頸靜脈竇取血，離心分離血清，檢測空腹血糖及胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)水平，計算胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitive index，ISI)，檢測胰島素敏感性變化，公式為ISI=ln［1/(FINS×FBG)］。

3.2超聲心動圖分別于糖尿病造模2周末、4周末，禁食禁水12 h，用濃度為0.6%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)按照5 mL/kg體重腹腔注射麻醉大鼠，固定于手術臺上，使用小動物超聲成像系統(tǒng)Vevo 2100(維勝中國)檢測左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal diastolic diameter，LVIDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-systole，LVIDs)、左室舒張末期室壁厚度(left ventricular posterior wall thickness in diastole，LVPWd)、左室收縮末期室壁厚度(left ventricular posterior wall thickness in systole，LVPWs)、短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)、左心室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)及左室質(zhì)量(left ventricular mass，LV mass)。

3.3標本收集造模結(jié)束后，大鼠麻醉，仰位固定，開腹，腹主動脈取血，每只5 mL，3 000 r/min離心10分鐘，取上清，分裝，－20℃保存待測。生化儀檢測TC、TG、HDL-C和LDL-C水平。迅速取出心臟，用冷生理鹽水洗凈，濾紙吸干，剔除血管、脂肪等非心肌組織，稱心臟重量(heart weight，HW)和左心室(含室間隔)重量(left ventricular weight，LVW)，并計算心臟(左心)指數(shù)=心臟(左心室)重量(mg)/體重(g)。分離的左心室再分為2部分:一部分用4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、透明、包埋，制成心肌組織蠟塊;另一部分置于EP管，于液氮中保存待用。

3.4ELISA檢測cTnI水平采用ELISA試劑盒檢測血清cTnI水平。

3.5HE染色取石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染色10 min，流水稍洗，體積分數(shù)1%的鹽酸乙醇分化，流水沖洗數(shù)分鐘，伊紅染色5 min，流水稍洗，梯度乙醇常規(guī)脫水，中性樹膠封片。Eclipse TE 2000-S熒光顯微鏡觀察心肌組織形態(tài)學的改變。

3.6Western blot實驗制備心肌組織勻漿，每20 mg組織加入100～200 μL含1 mmol/L PMSF的裂解液，4℃下14 000×g離心10 min，取勻漿上清，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度。20～50 μg總蛋白上樣量以濃度為8%的凝膠電泳進行分離。冰浴下恒流(300 mA)濕法轉(zhuǎn)膜2 h，體積分數(shù)5%的脫脂奶粉封閉1 h后與相應Ⅰ抗4℃共孵育過夜。TBST洗液洗滌，與辣根過氧化物標記的II抗共孵育，用增強型化學發(fā)光試劑進行顯色，并利用灰度分析軟件定量分析。

4統(tǒng)計學處理

應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示，組間差異比較采用方差分析及t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1大鼠DM模型建立情況

實驗期間，正常對照組大鼠狀態(tài)良好、健壯、皮毛油亮有光澤，自主活動正常，對外界反應靈敏。相比較，DM組大鼠逐漸表現(xiàn)體重降低，精神萎靡，皮毛無光澤，腥臊臭味加重等。造模成功大鼠18只，成功率為90%。

2造模后各組FBG、FINS和ISI情況

糖尿病模型組大鼠與對照組大鼠比較血清FBG 和FINS顯著升高，ISI下降，有顯著差異(P＜0.01)，表明2型糖尿病大鼠造模成功，見表1。

表1　造模后各組大鼠基本情況比較Table 1.The general characteristics of the rats after DM modeling (Mean±SD)

3心臟超聲檢測結(jié)果

與正常對照組比較，糖尿病模型組(2周、4周)大鼠的LVIDd及LVIDs值顯著增大(P＜0.05)，LVPWd及LVPWs不同程度增厚(P＜0.05)，F(xiàn)S、LVEF及LV mass值顯著降低(P＜0.05)，LV mass/body weight值增高; 4周模型組與2周模型組比較，4周模型組的LVPWd及LVPWs增厚程度更顯著(P＜0.05)，F(xiàn)S、LVEF和LV mass顯著降低(P＜0.05)，LV mass/body weight值明顯增高，見圖1、表2。

Figure 1.M-mode echocardiography of cardiac tissue from each group.圖1各組大鼠M-mode超聲心動圖代表圖像

表2　早期DM大鼠左室結(jié)構(gòu)參數(shù)及功能比較Table 2.The changes of the structural and functional parameters in the left ventricle of the early DM rats (Mean±SD)

4血生化指標檢測結(jié)果

與正常對照組比較，模型組(2周、4周)大鼠血清中FBG、TG、TC和LDL-C明顯升高(P＜0.05)。而4周DM模型組與2周DM模型組相比較，大鼠血清TG含量略有升高，HDL-C略有降低，二者之間比較差異不顯著，F(xiàn)BG、TC和LDL-C繼續(xù)升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3　早期DM大鼠血生化指標水平比較Table 3.The changes of the biochemical parameters in the early DM rats with different treatments (Mean±SD)

5大鼠體重及心臟各指標的測定結(jié)果

與正常對照組相比，4周DM組大鼠體重明顯降低(P＜0.01)，心臟及左心室重量變化不明顯;但心臟指數(shù)和左心室指數(shù)均高于對照組(P＜0.05) ; 4周DM組與2周DM組比較，左心室指數(shù)明顯升高(P＜0.05)，見表4。

6大鼠心肌組織病理觀察結(jié)果

正常對照組大鼠心肌紋理清晰，心肌組織細胞排列整齊，細胞核均勻分布，無變性、壞死等病理結(jié)構(gòu)改變。DM組大鼠心肌細胞胞漿豐富，細胞核由正常的圓形或橢圓形變?yōu)殚L桿狀，排列紊亂，2周模型組心外膜下心肌炎細胞浸潤，心內(nèi)膜出現(xiàn)心肌細胞壞死跡象，4周模型組心外膜下心肌壞死，少量成纖維細胞增生，心內(nèi)膜下出現(xiàn)少量心肌細胞變性、壞死，4周模型組較2周模型組心肌組織病理變化更明顯，見圖2。

表4　早期DM大鼠心臟取材相關指標測定Table 4.The parameters of the heart and body weight of the early DM rats with different treatments (Mean±SD)

Figure 2.HE staining of cardiac tissue from each group (×200).圖2各組大鼠心肌HE染色圖

7 ELISA檢測大鼠血清cTnI含量

與正常對照組比較，DM模型組血清的cTnI含量有不同程度的升高，模型組間存在差異，4周模型組比2周模型組更高(P＜0.05)，見圖3。

8大鼠心肌組織cTnI蛋白的表達

Western blot實驗結(jié)果表明2周、4周DM大鼠心肌中cTnI蛋白的表達相對于正常對照組明顯增加(P＜0.01)，且4周DM大鼠cTnI蛋白表達的增加更顯著(P＜0.01)，見圖4。

討論

心臟舒張功能降低是心功能降低的早期表現(xiàn)，之后伴隨著心肌組織學改變［2］。在2型糖尿病模型中，8周之前心功能處于持續(xù)減低狀態(tài)，心肌組織病理學及血清學也開始有改變。我們選取了糖尿病造模成功后4周之內(nèi)的大鼠模型，研究cTnI血清學的改變，以期早期發(fā)現(xiàn)糖尿病心肌病。

Figure 3.The expression of cTnI in serum detected by ELISA.Mean±SD.n=9.＊＊P＜0.01 vs control;△P＜0.05 vs 2-week DM.圖3 ELISA檢測大鼠血清cTnI含量

Figure 4.The expression of cTnI in cardiac tissue detected by Western blot.Mean±SD.n=9.＊＊P＜0.01 vs control;△△P＜0.01 vs 2-week DM.圖4 Western blot檢測大鼠心肌組織cTnI的表達

IR是2型糖尿病發(fā)病的重要始因，機體出現(xiàn)IR后，如果此時胰島β細胞受損或功能不足，即導致2型糖尿病的發(fā)生［3］。本實驗中高脂食物灌胃SD大鼠5周后，以30 mg/kg鏈脲佐菌素腹腔注射造模，3 d后測得大鼠血糖達到SD大鼠糖尿病標準(大于或等于11.1 mmol/L)，繼而以DeFrono等建立的EICT法［4］測得糖尿病大鼠ISI明顯低于對照組大鼠，表明糖尿病大鼠存在IR狀態(tài)，造模成功。高血糖和脂肪酸濃度的升高為主要表現(xiàn)的代謝紊亂是2型糖尿病主要特征［5-6］。本研究顯示，高脂模型條件下的DM模型，與正常對照組相比，DM大鼠血清TC、TG、LDL-C值有顯著升高，并呈現(xiàn)持續(xù)的高血糖狀態(tài)。Murfitt等［7］報道，早期糖尿病大鼠開始有心臟射血分數(shù)降低等左心功能性指標的改變，且已證實早期2型糖尿病大鼠模型存在心室舒張功能受損。本研究著重研究了2型糖尿病早期心肌改變，通過超聲心動圖評價早期糖尿病大鼠心肌結(jié)構(gòu)及功能改變，結(jié)果顯示，與正常對照組對比，模型組心肌呈現(xiàn)局部擴張，左室收縮及舒張功能指標都有所降低，尤其是左室舒張功能降低更顯著，心肌室壁有增厚趨勢，說明在糖尿病早期心肌在結(jié)構(gòu)上已經(jīng)發(fā)生局部改變，心功能也有降低趨勢。測量2型糖尿病大鼠心臟及左心重量，并計算心體比、左心指數(shù)，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心體比及左心指數(shù)均高于對照組，提示糖尿病大鼠存在心臟肥大趨勢。心肌組織病理可見糖尿病大鼠局部心肌細胞變性、壞死，亦說明糖尿病大鼠心肌細胞受到損傷。

cTnI是一種心肌細胞胞內(nèi)酶，正常時這些酶分子量大不能透過細胞膜，因而在血清中活力很低。但在糖尿病應激狀態(tài)下，心肌能量在短時間內(nèi)激增，代謝增強，相應酶合成增加，心肌細胞胞內(nèi)酶量增多［8］。cTnI為心肌特異抗原，具有高度的心肌特異性，對心肌損害高度敏感，并且由于目前為止其僅在心肌細胞中發(fā)現(xiàn)，而未在壞死心肌組織以外的任何其它部位發(fā)現(xiàn)，與骨骼肌亦無交叉反應性［9］。通過對糖尿病大鼠與正常對照組大鼠cTnI濃度的比較，我們得知糖尿病心肌病組cTnI濃度顯著升高，4周DM組較2周DM組大鼠血清cTnI水平也顯著增高，表明在糖尿病早期，cTnI的水平可能與心功能變化存在關聯(lián)。cTnI主要存在于心肌的收縮部位，作為心肌受損標志物，對于心肌的損傷特別敏感，可以作為心肌微小損傷的早期標志。糖尿病心臟微血管病變也引起心肌結(jié)構(gòu)損害，進一步引起心功能的變化，冠狀動脈血流儲備下降，心肌對缺血缺氧耐受閾值降低，內(nèi)皮依賴的血管舒張功能受損。本研究采用超聲心動圖，對DM早期心功能相關指標分析也印證了這一點。同時微血管痙攣和再灌注損傷，引起心肌細胞受損，最終發(fā)展成為心肌病。本實驗研究顯示，DM血清cTnI濃度增高，說明已有心肌細胞受損。在DM早期，其血清濃度呈現(xiàn)遞增趨勢，此指標對于診斷早期糖尿病心肌病有意義。

糖尿病心肌病是糖尿病性心臟病的特異性病變，是糖尿病心血管嚴重并發(fā)癥的重要組成部分，明確其發(fā)生發(fā)展過程中心肌相關指標的變化，進而做到早期診斷，成為研究熱點。本實驗揭示cTnI和心功能在早期DM心肌損傷中的變化趨勢，我們將進一步研究其產(chǎn)生及調(diào)節(jié)機制，以期為糖尿病心肌病的早發(fā)現(xiàn)早治療提供理論依據(jù)。

［參考文獻］

［1］Ramachandran A，Snehalatha C.Epidemiology of heart disease in type 2 diabetes［J］.Medicographia，2007，29 (1) : 207-212.

［2］Voulgari C，Papadogiannis D，Tentolouris N.Diabetic cardiomyopathy: from the pathophysiology of the cardiac myocytes to current diagnosis and management strategies ［J］.Vasc Health Risk Manag，2010，6: 883-903.

［3］Kobayashi S，Liang QR.Autophagy and mitophagy in diabetic cardiomyopathy［J］.Biochimicaet Biophysica Acta，2015，1852(2) : 252-261.

［4］Francisco W，Mario NM，Camila LC，et al.Defective insulin signaling and mitochondrial dynamics in diabetic cardiomyopathy［J］.Biochim Biophys Acta，2015，1853 (5) : 1113-1118.

［5］Sertoglu E，Kurt I，Tapan S，et al.Comparison of plasma and erythrocyte membrane fatty acid compositions in patients with end-stage renal disease and type 2 diabetes mellitus［J］.Chemi Physics Lipids，2014，178(2) : 11-17.

［6］Bai SZ，Sun J，Wu H，et al.Decrease in calcium-sensing receptor in the progress of diabetic cardiomyopathy［J］.Diabetes Res Clin Prac，2012，95(3) : 378-385.

［7］Murfitt L，Whiteley G，Iqbal MM，et al.Targeting caveolin-3 for the treatment of diabetic cardiomyopathy［J］.Pharmacol Ther，2015.151: 50-71.

［8］Asghar O，Al-Sunni A，Khavandi K，et al.Diabetic cardiomyopathy［J］.Clin Sci (Lond)，2009，116(10) : 741-760.

［9］Moriyama T，Kemi M，Okumura C，et al.Involvement of advanced glycation end-products，pentosidine and Nε-(carboxymethyl) lysine，in doxorubicin-induced cardiomyopathy in rats［J］.Toxicology，2010，268(1-2) : 89-97.

(責任編輯:陳妙玲，余小慧)

Changes of heart function and serum cardiac troponin I in early type 2 diabetic rats

YIN Mao-shan1，2，XU Shu-hong3，MU Yan-ling2
(1School of Medicine and Life Sciences，University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences，Jinan 250200，China;2Institute of Materia Medica，Shandong Academy of Medical Sciences，Jinan 250062，China;3China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China.E-mail: myling501@hotmail.com)

［ABSTRACT］AIM: To observe the changes of heart function and the expression of serum cardiac troponin I (cT-nI) in early type 2 diabetic rats，and to explore the role of cTnI in the development of type 2 diabetes and early diabetic cardiomyopathy.METHODS: The type 2 diabetes rat model was established by an injection of streptozotocin after high fat diet (5 weeks).The rats were randomly divided into control group，model group of 2 weeks，and model group of 4 weeks.M-mode echocardiography was performed for echocardiographic measurements.Fasting blood glucose (FBG)，total cholesterol (TC)，triglyceride (TG)，high density lipoprotein-cholesterol (HDL-C)，low density lipoprotein-cholesterol (LDLC)，fasting insulin (FINS) and cTnI levels were tested.HE staining was used to observe the pathological changes of myocardial structures.The alteration of cTnI in myocardium was determined by Western blot.RESULTS: Compared with normal group，the levels of TC，TG and LDL-C in type 2 diabetic rats were significantly increased，HDL-C levels were significantly reduced.Cardiac histological analysis revealed that type 2 diabetes induced cardiomyocytes degeneration and necrosis.The expression of cTnI increased significantly in diabetic groups compared to control group，and that in model group of 4 weeks increased far more than that in model group of 2 weeks (P＜0.05).CONCLUSION: The increased level of cTnI and the change of the heart function may be associated with the development diabetic cardiomyopathy.These changes are valuable for the early clinical diagnosis of myocardial injury in diabetic cardiomyopathy.

［KEY WORDS］Cardiac troponin I; Heart function; Type 2 diabetes mellitus; Myocardial injury

通訊作者△Tel: 0531-82612443; E-mail: myling501@hotmail.com

*［基金項目］國家自然科學基金資助項目(No.30701022) ;山東省優(yōu)秀中青年科學家科研獎勵基金計劃(No.BS2013SW008)

［收稿日期］2015-06-08［修回日期］2015-08-04

［文章編號］1000-4718(2015)09-1709-06

［中圖分類號］R587.1; R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.032