體外循環(huán)30 min對紅細胞膜的表面結(jié)構(gòu)及力學特性的影響*

聶　偲，佘高明，李雅蘭，胡冬華，唐杰坷，廖　婧，周　婷，田　和，王菲菲(暨南大學附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣東廣州510632)

體外循環(huán)30 min對紅細胞膜的表面結(jié)構(gòu)及
力學特性的影響*

聶偲，佘高明，李雅蘭△，胡冬華，唐杰坷，廖婧，周婷，田和，王菲菲
(暨南大學附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣東廣州510632)

［摘要］目的:應用原子力顯微鏡(AFM)觀察和分析體外循環(huán)(又稱心肺分流術，CPB) 30 min對紅細胞膜表面的超微結(jié)構(gòu)和生物力學性能的影響。方法:擇期行體外循環(huán)心臟手術患者10例，分別取手術前和體外循環(huán)轉(zhuǎn)機30 min的中心靜脈血各2 mL，分為對照(CON)組和CPB組，肝素抗凝。正立熒光顯微鏡觀察計數(shù)2組非圓紅細胞; AFM觀察紅細胞膜表面超微結(jié)構(gòu)并進行力曲線測定。結(jié)果:與CON組比較，CPB組非圓紅細胞比例差異無統(tǒng)計學意義;與CON組比較，CPB組細胞膜表面隆起呈紊亂排列，凹凸性增強，均勻度下降，膜表面顆粒分布有差異(P＜0.05)，平均粗糙度(Ra)和均方根粗糙度(Rq)增大(P＜0.05)，細胞膜黏附力升高(P＜0.05)，但膜形變恢復力和力曲線斜率差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論:體外循環(huán)轉(zhuǎn)機30 min可以引起紅細胞膜的表面形貌和超微結(jié)構(gòu)改變，黏附性增大。

［關鍵詞］心肺分流術;紅細胞;原子力顯微鏡;生物力學

［修回日期］2015-04-02

原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)能對生物樣品進行原子量級的成像，制樣簡單，無侵入性，提供的高分辨圖像可研究細胞膜的表面形貌和超微結(jié)構(gòu)，測定的力曲線可分析納米級的力學特性，在細胞生物學研究中廣泛應用［1-2］。體外循環(huán)(又稱心肺分流術，cardiopulmonary bypass，CPB)后的并發(fā)癥以血液損害最明顯，轉(zhuǎn)流下紅細胞破壞，變形性下降，聚集性加強，細胞腫脹甚至發(fā)生溶血。目前有關體外循環(huán)對紅細胞的影響多關注其脆性、壓積、變形性或紅細胞三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、血紅蛋白達50%氧飽和度時的氧分壓(P50)、2，3-二磷酸甘油酸(2，3-diphosphoglycerate，2，3-DPG)含量等［3-4］，缺少對紅細胞表面超微結(jié)構(gòu)及力學特性的分析，故本研究擬通過AFM觀察術中紅細胞表面形貌和機械性能的改變，探討體外循環(huán)可能對紅細胞膜超微結(jié)構(gòu)及生物力學的影響。

材料和方法

1病例選擇

選取本院2013年3月～2014年10月行體外循環(huán)心內(nèi)直視手術者10例，男5例，女5例，年齡45～62歲，體重42～68 kg，其中二尖瓣置換7例，先天性室間隔缺損修補術1例，房間隔缺損修補術2例，心功能Ⅱ～Ⅲ級，無肝、腎及凝血功能障礙。取術前和體外循環(huán)轉(zhuǎn)機30 min的中心靜脈血各2 mL，分為對照(control，CON)組和CPB組，肝素抗凝。

2麻醉和體外循環(huán)方法

手術前30 min肌注苯巴比妥100 mg和阿托品0.5 mg，入室后行頸內(nèi)靜脈穿刺置管、橈動脈穿刺測壓，靜注咪達唑侖、芬太尼、依托咪酯和阿曲庫銨麻醉誘導，丙泊酚、芬太尼、阿曲庫銨和七氟烷麻醉維持。采用STOCKERTⅢ人工心肺機，Maquet膜式氧合器，Maquet血液濃縮器，無血預充，轉(zhuǎn)流在中度低溫、中度血液稀釋和中高流量灌注下進行。

3標本的采集和處理

分別于手術開始前和轉(zhuǎn)機30 min取中心靜脈血2 mL，肝素鈉(1×104U/L)抗凝，置15 mL離心管中，4℃冰箱保存。制片時血樣在室溫恢復約1 h，經(jīng)等滲PBS沖洗3次，最后加入PBS將紅細胞稀釋50～60倍，取10 μL滴于蓋玻片上，1%的戊二醛固定15 min，蒸餾水沖洗5次，濾紙吸凈多余液，室溫下過夜風干。

4熒光正立顯微鏡觀察紅細胞

取2組紅細胞，在400倍放大率下瀏覽玻片，隨機選取細胞分布均勻的區(qū)域，計數(shù)1 000個紅細胞中的非圓紅細胞數(shù)，計算非圓紅細胞的百分比，取均數(shù)作比較。

5 AFM觀察紅細胞

樣品置于NanoScope V AFM(Veeco Instruments)載物臺上，Olympus倒置顯微鏡觀察紅細胞的分散情況，選擇分散均勻的區(qū)域進行掃描。選擇Nanoscope 8.10 Catalyst模式，ScanAsyst成像，Tap 150 AI-G硅探針。每例樣本掃描3個區(qū)域，掃描范圍依次為30 μm×30 μm、10 μm×10 μm(單個紅細胞) 和1 μm×1 μm (紅細胞膜表面)的區(qū)域，掃描速率為0.15～1.0 Hz。

力曲線列表中預設相關參量，圖像自動重復捕捉，采集結(jié)果為計算機測量數(shù)次后得到的平均力曲線，每例樣本測量3個細胞，每個細胞采集2條力曲線。所有力曲線都在統(tǒng)一加載速率下測得。

6統(tǒng)計學處理

NanoScope Analysis Version 1.20軟件進行圖像的采集并進行平滑處理。SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

CON組和CPB組非圓紅細胞比例分別為(6.2±0.3) %和(7.4±0.4) %。與CON組比較，CPB組非圓紅細胞比例無明顯改變，見圖1。

2組紅細胞三維形貌圖見圖2、3。CON組紅細胞呈現(xiàn)典型的單凹圓盤狀，細胞輪廓清晰、表面光滑、弧線流暢，紅細胞膜柔軟，易發(fā)生變形; CPB組紅細胞形態(tài)完整，但兩側(cè)高度不一，膜表面凹凸明顯，細胞中心低平，有大顆粒雜亂分布。

Figure 3.AFM 3D morphological images (front) of the overall erythrocytes in control (CON) group and 30 min after cardiopulmonary bypass (CPB) group.圖3 2組單個紅細胞三維正面形貌圖

與CON組比較，CPB組紅細胞平均直徑、平均高度和平均凹度差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1　2組紅細胞形貌參數(shù)比較Table 1.Comparison of the erythrocyte surface topography properties (μm.Mean±SD.n=10)

2組紅細胞局部三維形貌圖見圖4、5。CON組紅細胞膜表面由大小不同的隆起形成，隆起光滑，分布均勻、疏密有度; CPB組紅細胞膜表面隆起狀結(jié)構(gòu)依然存在，但膜表面相對粗糙，隆起分布不均勻，呈紊亂排列。與CON組比較，CPB組表面粗糙度增大(P＜0.05)，見表2。

2組細胞膜表面顆粒高度分布見圖6。CON組膜表面顆粒高度的整體分布均衡，無明顯缺失。CPB組膜表面顆粒高度分布不均衡。與CON組比較，CPB組顆粒高度增大(P＜0.05)。

Figure 4.AFM 3D ultrastructure morphological images of the erythrocytes in control (CON) group and 30 min after cardiopulmonary bypass (CPB) group.圖4兩組紅細胞局部三維形貌圖

Figure 5.AFM 3D ultrastructure peak force error images of the erythrocytes in control (CON) group and 30 min after cardiopulmonary bypass (CPB) group.圖5 2組紅細胞局部三維誤差信號圖

表2　2組紅細胞膜表面粗糙度比較Table 2.Comparison of the erythrocyte surface roughness (nm.Mean±SD.n=10)

2組紅細胞膜所測力曲線見圖7，與CON組比較，CPB組壓痕深度及其對應的膜表面形變恢復力無明顯改變(P＞0.05)。但細胞膜黏附力增大，對應的跳離距離增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表3。

力曲線的斜率反映的是探針壓向樣品時偏移的程度，由此可評估細胞表面的彈性，斜率越大，細胞彈性越好。CON組細胞力曲線的斜率約為1.105± 0.127，CPB組斜率約為1.081±0.082，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

Figure 6.Histogram of erythrocyte membrane nanoparticles in control (CON) group and 30 min after cardiopulmonary bypass (CPB) group.圖6 CON組與CPB組細胞膜表面顆粒高度分布圖

Figure 7.The erythrocyte membrane force-distance curves in control (CON) group and 30 min after cardiopulmonary bypass (CPB) group.圖7 CON組與CPB組紅細胞膜所測力曲線代表圖

表3　2組力曲線反映的力學性質(zhì)參數(shù)比較Table 3.Comparison of mechanical properties indicated by the force-distance curves (Mean±SD.n=10)

討論

細胞形態(tài)與其功能相適應。紅細胞結(jié)構(gòu)簡單、形態(tài)特殊，其柔韌性和變形性(red cell deformability，RCD)是機體完成多種生理功能，進行有效微循環(huán)灌注的基礎;這些特性與膜結(jié)構(gòu)和細胞骨架(cytoskeleton)支撐相關。體外循環(huán)時人工管道、氣血接觸、切變力、低溫、機械擠壓、炎癥反應等因素綜合作用，影響膜骨架的整齊有序性，易導致紅細胞的直接破碎和胞膜的受損［5-6］。

體外循環(huán)后紅細胞形態(tài)改變，異常紅細胞變形能力下降、聚集性增強，易淤積于微循環(huán)，導致灌注不良。有研究通過電鏡觀察轉(zhuǎn)流后的心肌組織切片，發(fā)現(xiàn)紅細胞成“緡錢狀”，不能像轉(zhuǎn)流前通過變形穿過毛細血管［7］。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)流前后均存在一定的非圓紅細胞，且2組數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義。其可能原因為轉(zhuǎn)流時間較短(30 min)，并使用膜式氧合器和血液濃縮器，減少血液稀釋，去除部分炎癥介質(zhì)，降低了對細胞的損傷。

體外循環(huán)期間多種因素影響RCD。血液過度稀釋，膠體滲透壓下降，體液向細胞內(nèi)和組織間隙轉(zhuǎn)移，造成紅細胞表面積∕體積下降，RCD降低［4］。在一定范圍內(nèi)RCD隨切變力增加而增高，一旦超過閾值，變形性將大幅下降［8］。體外循環(huán)中血液流經(jīng)不同管道，滾壓泵不斷對其擠壓，血液切變力改變影響RCD。此外，溫度對其也有影響，在5～37℃的范圍內(nèi)RCD隨溫度升高而升高［9］。體外循環(huán)中機體保持26～28℃的中度低溫，同樣可能導致RCD下降。

利用AFM成像發(fā)現(xiàn)體外循環(huán)30 min的單個紅細胞整體形態(tài)發(fā)生改變。CPB組細胞膜表面光滑度降低，中心區(qū)域有大顆粒狀雜亂分布，細胞直徑變長，高度降低，整體更為扁平。滾壓泵擠壓會對紅細胞產(chǎn)生損傷，但對細胞體積影響不大［10］，這可能是CPB組紅細胞整體形態(tài)改變輕微的原因。

AFM局部超微形貌圖中可觀測到多處隆起或顆粒，這些顆粒從幾納米到幾百納米不等，結(jié)合以往文獻，考慮為細胞膜上大小不一的分子和蛋白，是膜蛋白結(jié)構(gòu)和數(shù)量的微觀表現(xiàn)。CPB組膜蛋白重組，超微結(jié)構(gòu)改變，膜表面粗糙度增大。體外循環(huán)血液稀釋和低灌注引發(fā)氧自由基大量釋放、補體激活，可能直接改變了膜蛋白結(jié)構(gòu)，或?qū)Φ鞍姿獾拿舾行栽黾?，產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物也可引起蛋白水解，結(jié)果使紅細胞表面構(gòu)型改變［11］。

有文獻報道，AFM觀察的細胞膜表面形貌結(jié)構(gòu)改變可能與其功能改變相關［12］，細胞的機械性能也反映其生理病理過程［13］。RCD與細胞的粘附力和彈性有關;細胞膜粘附力增大或彈性降低，都會使RCD降低。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)流30 min，2組紅細胞膜表面形變恢復力和彈性變化不明顯，推測這一過程中，細胞骨架僅發(fā)生了輕微改變。但CPB組的細胞膜黏附力明顯增大，說明RCD受到影響。體外循環(huán)開始后，受血液中變性蛋白、氧自由基等作用，大量Ca2+內(nèi)流，引起膜蛋白水解、聚集、連接構(gòu)象改變，紅細胞膜的機械特性發(fā)生變化;同時鈣超載引發(fā)細胞膜的骨架結(jié)構(gòu)和脂質(zhì)雙分子層組分改變，使膜脂流動性減小，黏附力增加［14］。正常紅細胞表面帶有負電荷，轉(zhuǎn)流后負電荷減少，細胞間排斥力減小，膜黏附力相應增加。

體外循環(huán)后紅細胞的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變。研究報道體外循環(huán)術后1 d即出現(xiàn)紅細胞內(nèi)糖酵解途徑受抑制，如果術中應用胰島素則可以明顯改善紅細胞糖代謝功能，提高紅細胞的抗氧化能力［15］。體外循環(huán)期間急性血流動力學紊亂會導致毛細血管灌注異常，減少機體對氧的攝取，但也有文獻認為體外循環(huán)后，紅細胞的攜氧能力不變，僅RCD發(fā)生改變［16-17］。

綜上所述，體外循環(huán)轉(zhuǎn)機30 min可致患者紅細胞膜表面超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，表現(xiàn)為細胞膜表面隆起排列紊亂，凹凸性增強，均勻度降低，膜表面粗糙度增大，細胞間的黏附性增強，影響紅細胞的變形性。

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(責任編輯:林白霜，羅森)

Effect of cardiopulmonary bypass for 30 min on structure and mechanical properties of erythrocyte membrane surface

NIE Cai，SHE Gao-ming，LI Ya-lan，HU Dong-hua，TANG Jie-ke，LIAO Jing，ZHOU Ting，TIAN He，WANG Fei-fei
(Department of Anesthesiology，The First Affiliated Hospital of Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail: tyalan@jnu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To observe and analyze the effect of cardiopulmonary bypass (CPB) for 30 min on surface ultra-structure and mechanical properties of the erythrocyte membrane by atomic force microscopy (AFM).METHODS: Ten cases of elective patients in cardiac surgery were selected in the study and divided into control (CON) group and CPB group.The central venous blood (2 mL) before surgery and 30 min after CPB was collected with heparin anticoagulation.The non-circular red blood cells were counted under a stand fluorescence microscope.AFM was used to examine the ultrastructure of the membrane surface and measure the force curve of the erythrocytes.RESULTS: The percentage of non-circular red blood cells in CPB group showed no statistically significant differences as compared with CON group.AFM images showed that the significant differences of membrane surface concave and convex，evenness，particle distribution，the surface average roughness (Ra)，the surface root mean square roughness (Rq) and cell membrane adhesion between CPB group and CON group were observed.However，the membrane deformation resilience and curve slope had no significant difference between the 2 groups.CONCLUSION: Cardiopulmonary bypass for 30 min changes the morphology and ultrastructure of the erythrocyte membrane surface，and increases the adhesion between cells.

［KEY WORDS］Cardiopulmonary bypass; Erythrocytes; Atomic force microscopy; Biomechanics

通訊作者△Tel: 020-38688200; E-mail: tyalan@jnu.edu.cn

*［基金項目］中華醫(yī)學會專項基金資助項目(No.20140301) ;天河區(qū)科技計劃項目(No.201404KW041)

［收稿日期］2015-01-23

［文章編號］1000-4718(2015)09-1611-06

［中圖分類號］R363; R331.1+41

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.014