Maspin在非小細胞肺癌A549細胞生物學行為中的作用*

周　珺，周　鵬，秦華龍，，國　風△(蘇州大學附屬第一醫(yī)院中心實驗室，胸外科，江蘇蘇州5006)

Maspin在非小細胞肺癌A549細胞生物學行為中的作用*

周珺1，周鵬1，秦華龍1，2，國風1△
(蘇州大學附屬第一醫(yī)院1中心實驗室，2胸外科，江蘇蘇州215006)

［摘要］目的:探討乳腺絲氨酸蛋白酶抑制物(maspin)對于非小細胞肺癌細胞生物學有何影響及其作用機制。方法: PCR擴增人類maspin編碼區(qū)全長，并構建maspin過表達載體，轉染A549細胞。藥物篩選出穩(wěn)定高表達maspin蛋白的細胞株，并通過real-time PCR和Western blot鑒定。通過xCelligence系統(tǒng)實時動態(tài)觀測轉染后A549細胞的生長、遷移和侵襲情況。利用Western blot和real-time PCR的方法對此細胞生物學變化的相關基因進行分析，探討相應的作用機制。結果:成功構建過表達Maspin的載體MSCV-maspin，并獲得穩(wěn)定高表達maspin的A549細胞株(A549-maspin)。A549-control細胞和A549-maspin細胞生長曲線無差異，但是遷移和侵襲曲線有顯著差異。在A549-maspin細胞中integrin β1的表達水平低于A549-control細胞。結論: Maspin對于A549細胞的生長無影響，但是抑制了A549細胞的遷移和侵襲能力，并且此抑制作用與integrin β1相關。

［關鍵詞］非小細胞肺癌;乳腺絲氨酸蛋白酶抑制物;細胞遷移;細胞侵襲

乳腺絲氨酸蛋白酶抑制物(mammary serine protease inhibitor，maspin)是從正常乳腺上皮細胞中發(fā)現的蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶抑制物(serine protease inhibitors，serpins)超家族成員，與其它serpins成員有30%～40%的同源性［1］。在乳腺癌和前列腺癌等多種實體瘤中，maspin被認為是一個抑癌基因。肺癌是目前發(fā)病和死亡最高的腫瘤疾病，肺癌80%左右都是非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)。Maspin在不同肺癌中作用和表現并不一致。有研究報道稱，高表達的maspin提示良好的預后，但僅適用于肺鱗癌而并不適用于肺腺癌［2］。Maspin在細胞內定位不同，其生物學功能和臨床意義也不同，胞漿內出現maspin提示預后不良，胞核內出現則預后較好［3］。Maspin一般通過抑制腫瘤血管生成及侵襲和轉移、促進腫瘤細胞凋亡發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用。關于maspin在肺癌中的作用及其作用機制研究報道并不多。本研究通過建立高表達maspin非小細胞肺癌細胞株，研究其細胞生物學行為的變化，探討maspin對NSCLC的影響及其作用機制。

材料和方法

1主要儀器、試劑和抗體

流式細胞儀FASCalibur購自BD;熒光倒置顯微鏡購自Olympus; NanoDrop分光光度計購自Thremo; xCelligence細胞實時動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)和LightCycler 480熒光定量PCR儀都購自Roche; Odyssey熒光掃描成像系統(tǒng)購自Li-COR; RPMI-1640和DMEM購自Gibco;胎牛血清購自杭州四季青; SYBR Green Mix、轉染試劑Fugene HD和蛋白酶抑制劑都購自Roche;逆轉錄試劑M-MLV和TA克隆試劑盒購自Invitrogen;質粒提取試劑盒購自Omega; maspin抗體購自BD;尿激酶類纖溶酶原激活因子(urokinase-type plasminogen activator，uPA)抗體購自Santa Cruz;整合素β1 (integrin β1，ITGB1)、ERK、Akt、p-Akt和p-PDK1購自CST;β-actin抗體購自CMCTAG。

2細胞培養(yǎng)

肺腺癌細胞株A549、H460、PC-9和SPC-A1為本實驗室長期保存，完全培養(yǎng)基為含10%胎牛血清，1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2的飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Phoenix A包裝細胞(中科院動物所趙勇教授贈送)使用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。選用生長良好的對數生長期細胞進行后續(xù)實驗。

3實驗方法

3.1Maspin過表達載體構建根據NCBI數據庫提供的人類maspin基因編碼區(qū)全長設計引物，其中正向引物為5’-CTCCAGGCCCGCAATGGATGCC-3’，反向引物為5’-GGGCTATGCCACTTAAGGAG-3’，由Invitrogen合成。由人乳腺正常組織PCR擴增獲得maspin編碼區(qū)全長，通過TA克隆接入pCR2.1載體中，再酶切連接到含GFP的MSCV載體。最終獲得的質粒送蘇州金唯智生物技術公司測序確認。

3.2建立穩(wěn)定轉染的maspin過表達細胞株在35 mm培養(yǎng)皿中接種Phoenix A包裝細胞，使第2天轉染時融合度達到70%～80%。用Fugene HD轉染試劑，按照產品說明進行轉染。使用包裝載體pCL和MSCV-maspin共同轉染Phoenix A包裝細胞，18 h后熒光顯微鏡觀察轉染效率，換新鮮培養(yǎng)基，48 h后收集病毒上清，并用此病毒上清轉染靶細胞A549。其中使用空載體MSCV作為對照，同樣進行轉染。利用嘌呤霉素(5 mg/L)篩選，最終獲得穩(wěn)定轉染的細胞株。

3.3實時熒光定量PCR(real-time PCR)Trizol一步法提取細胞總RNA，并用NanoDrop定量RNA濃度和質量。取2 μg RNA按照逆轉錄試劑說明，利用M-MLV逆轉錄合成cDNA。實時熒光定量PCR在LightCycler 480熒光定量PCR儀上進行。每個反應設3復孔，40個循環(huán)。以β-actin作為內參照，檢測每個反應孔中熒光達到設定值是所經歷的循環(huán)數(即Ct值)，基因mRNA相對表達水平用2－ΔΔCt計算。引物設計用NCBI的Primer-BLAST，具體引物見表1。

表1　實時定量PCR所用引物序列

3.4Western blot按照標準蛋白提取方法，使用RIPA buffer提取細胞全蛋白。經過10% SDS丙烯酰胺凝膠電泳后，半干轉到硝酸纖維膜上。用5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入I抗，4℃孵育過夜。PBST洗膜后，加入熒光II抗，室溫孵育45 min。PBST洗膜后，上Odyssey儀器成像檢測。

3.5實時動態(tài)細胞分析利用xCelligence系統(tǒng)和RTCA 1.2軟件進行細胞指數(cell index)的實時動態(tài)監(jiān)測。“細胞指數”是由測得的電阻抗推算出的一個無量綱參數，它與黏附上去的細胞數量直接相關。當系統(tǒng)專用的培養(yǎng)板(E-plate或CIM-plate)中未加細胞時，各個培養(yǎng)孔中的“細胞指數”相同，為起始空白值;當加入細胞后，隨著細胞的貼壁和增殖生長，由此產生的電阻抗信號產生變化，即細胞貼壁多，信號高，“細胞指數”數值大。按照儀器使用說明分別進行細胞生長、遷移和侵襲的監(jiān)測分析。

3.6Ki-67免疫組化染色檢測細胞增殖細胞在涂膠片上分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。用4%的中性甲醛固定涂膠片30 min，再用PBST溶液洗滌10 min。用含10%胎牛血清的PBS室溫封閉45 min后，加入Ki-67抗體(Dako) 4℃孵育過夜。PBS洗滌后，加II 抗(GTVision III免疫組化試劑盒，DAB顯色后，在顯微鏡下觀察，計數Ki-67染色陽性細胞。

3.7TUNEL檢測細胞凋亡細胞在涂膠片上分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。根據TUNEL試劑盒(Roche)說明進行實驗。用4%的中性甲醛固定涂膠片30 min，分別用PBS和3% H2O2甲醇溶液室溫浸泡10 min，再用預冷的PBST處理2 min。滴加TUNEL反應液37℃避光孵育1 h。PBS洗滌后，用POD在37℃處理30 min。DAB顯色后，在顯微鏡下觀察，計數TUNEL染色陽性細胞。

4統(tǒng)計學處理

實驗至少重復3次，數值以均數±標準差(mean±SD)表示，采用GraphPad Prism軟件進行t檢驗或單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 Maspin在不同肺癌細胞株中的表達情況

肺腺癌PC-9和大細胞肺癌H460細胞株中maspin的mRNA表達顯著高于肺腺癌A549和SPCA1細胞株。Western blot的蛋白檢測結果也與realtime PCR結果一致，maspin蛋白在肺腺癌A549和SPC-A1細胞株中的表達明顯要低于肺腺癌PC-9和大細胞肺癌H460細胞株。以下實驗選擇A549作為maspin高表達的靶細胞，見圖1。

Figure 1.The mRNA (A) and protein (B) expression of maspin in NSCLC cell Iines.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs A549 and SPC-A1.圖1 Maspin在肺癌細胞株中的表達水平

2穩(wěn)定高表達maspin細胞株的建立和鑒定

通過設計的特異性引物PCR擴增獲得maspin基因編碼區(qū)全長，同過TA克隆連接到pCR2.1載體，再通過EcoR I酶切連接到最終的MSCV載體，獲得maspin表達質粒MSCV-maspin，見圖2。

把質粒MSCV-maspin與包裝質粒pCL共同轉染包裝細胞Phoenix A，用收集的病毒上清感染靶細胞A549。通過嘌呤霉素篩選，并挑選克隆化的集落，獲得穩(wěn)定轉染的克隆化細胞株A549-maspin。通過熒光顯微鏡觀察，A549-maspin細胞的熒光陽性率大于90%，并且通過流式細胞術進一步確證，見圖3。

通過real-time PCR可以看到，A549-maspin細胞中maspin mRNA表達明顯高于對照細胞(P＜0.01)，并且在Western blot結果上也得到驗證，在蛋白水平上A549-maspin細胞中maspin表達要顯著高于A549-control細胞(P＜0.01)，見圖3。以上結果證明我們成功建立了穩(wěn)定高表達maspin的細胞株A549-maspin。

3 Maspin高表達對A549細胞生長的影響

每孔接種8 000細胞在E-plate，通過xCelligence系統(tǒng)連續(xù)實時動態(tài)監(jiān)測細胞生長72 h?！凹毎笖怠鼻€結果顯示A549-maspin細胞與A549-control對照細胞在生長上差異并無統(tǒng)計意義，而且通過RTCA 1.2軟件計算得出倍增時間，其中A549-maspin為(21.12±5.66) h，A549-control為(18.50±2.82) h，因此maspin對于A549的生長并無顯著影響。此外，24 h、48 h及72 h的Ki-67陽性細胞計數在對照細胞和A549-maspin細胞中都無明顯差異，并且TUNEL陽性細胞計數在這2種細胞中也無顯著差異，見圖4。因此，maspin的過表達并未影響A549細胞的增殖和凋亡。

4 Maspin對生長相關信號通路的影響

細胞生長與Akt信號通路密切相關，因此通過Western blot方法檢測了Akt信號通路的部分蛋白，結果顯示這些蛋白的表達在A549-maspin細胞與A549-control對照細胞中并無差異，見圖5。因此maspin的過表達并未影響A549細胞的Akt信號通路。

5 Maspin高表達對A549細胞遷移和侵襲的影響

每孔接種40 000細胞在CIM-plate，通過xCelligence系統(tǒng)連續(xù)實時動態(tài)監(jiān)測細胞24 h。結果顯示A549-maspin細胞的“細胞指數”曲線自4 h起就低于A549-control對照細胞(P＜0.01)，并隨著時間差異越來越顯著。類似的現象在分析細胞侵襲時同樣發(fā)生了，在15 h A549-maspin細胞“細胞指數”開始落后于A549-control對照細胞(P＜0.05)，在16 h后A549-maspin細胞“細胞指數”滯后明顯(P＜0.05)，見圖6。因此，maspin抑制了A549的遷移和侵襲能力。

Figure 2.Schematic diagram of MSCV-maspin plasmid.圖2過表達Maspin質粒MSCV-maspin的結構示意圖

Figure 3.Establishment and identification of maspin over-expression cell line.Scale bar=100 μm.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs A549-control.圖3穩(wěn)定表達maspin的轉染細胞A549-maspin的篩選和鑒定

為了進一步探討maspin抑制遷移和侵襲的機制，檢測了部分侵襲相關蛋白的表達情況。Realtime PCR的結果顯示uPA、uPAR、MMP2和MMP9在A549-maspin細胞和A549-control對照細胞中并無差異，而ITGB1的mRNA在A549-maspin細胞中的表達明顯低于A549-control細胞。Western blot檢測結果也進一步證實，在A549-maspin細胞中integrin β1蛋白表達降低了，見圖7。過表達Maspin抑制了A549中integrin β1的表達。Maspin可能是通過降低integrin β1的表達抑制A549細胞的遷移和侵襲。

Figure 4.The effect of maspin on the growth of A549 cells.Mean±SD.n=5.圖4 Maspin對A549細胞生長的影響

Figure 5.The effect of maspin on Akt signaling pathway in A549 cells.Mean±SD.n=3.圖5 Western blot檢測A549細胞生長相關信號通路的蛋白水平

討論

本研究結果顯示maspin對于非小細胞肺癌細胞株A549的生長無顯著影響，并且在A549細胞中過表達maspin對Akt信號通路的活化亦無明顯影響。過表達maspin抑制A549細胞的遷移和侵襲能力與integrin β1的下調相關，而uPA和uPAR以及金屬蛋白酶MMP9和MMP2并未受過表達maspin的影響。

Maspin自從發(fā)現以來，通常被認為是腫瘤抑制因子。它的腫瘤抑制作用表現為誘導凋亡、抑制腫瘤細胞生長、抑制腫瘤細胞的轉移和侵襲等。在前列腺癌細胞中maspin受RelB的負調控，從而影響細胞生長、腫瘤發(fā)生發(fā)展以及腫瘤細胞的藥物敏感性［4-5］。另有研究表明，maspin可以通過促凋亡分子Bax的介導促進細胞凋亡和抑制前列腺癌細胞的生長［6］。在本研究中，通過xCelligence系統(tǒng)實時監(jiān)測對照細胞和A549-maspin細胞的生長，發(fā)現2種細胞生長并無顯著差異，同時Ki-67和TUNLE實驗結果顯示細胞增殖和細胞凋亡也無顯著差異。研究顯示，在肺癌細胞的增殖和生存中，PI3K/Akt通路起著重要作用［7］。在前列腺癌細胞Du-145中，過表達maspin通過抑制Akt活化使得細胞對由缺氧引起的細胞凋亡更敏感［8］。Maspin通過調節(jié)Akt控制NSCLC細胞H157的藥物敏感性和細胞生存［9］。抑制Akt活性能夠在NSCLC細胞中促進由化療和放療誘導的凋亡［10-11］。在本研究中，Akt和磷酸化Akt在對照細胞和A549-maspin細胞中的蛋白水平并無差異，即在A549細胞中過表達maspin并未影響Akt信號通路的活化，可能是過表達maspin并不影響A549細胞生長、增殖和凋亡的原因之一。值得注意的是A549存在著Kras突變(G12S)。Kras的突變會使得PI3K/Akt通路的異常活化［12］。對照細胞和A549-maspin細胞中PI3K/Akt通路均處于活化狀態(tài)，而maspin的過表達不足以影響Akt的活化。因此我們推測在A549細胞中Kras突變是細胞生長的主要驅動因素而非PI3K/Akt信號通路。

Figure 6.The effects of maspin on the migration and invasion of A549 cells.Mean±SD.n=4.圖6 Maspin對A549遷移和侵襲的影響

Maspin能夠抑制多種腫瘤細胞(如乳腺癌和前列腺癌)的遷移和侵襲。MMP9和MMP2屬是基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)家族成員，能夠蛋白酶解細胞外不同基質成分。腫瘤細胞通過表達MMPs改變細胞外基質，增加侵襲能力。研究表明，mMPs參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個階段，包括腫瘤細胞增殖、分化、凋亡、黏附、遷移以及腫瘤的侵襲和轉移［13］。研究表明過表達MMP2和MMP9能夠促進肺癌腫瘤惡化以及降低生存率［14-15］。有研究表明maspin作為絲氨酸蛋白酶抑制劑可以降低uPA和uPAR的水平，從而影響uPA/uPAR對細胞外基質的降解作用，抑制細胞的侵襲［16］。還有研究表明maspin可以通過調節(jié)uPA和Rac-1 Rho GTPase的活性從而抑制細胞遷移和侵襲［17-19］。在本研究中，我們通過xCelligence系統(tǒng)實時監(jiān)測了對照細胞和A549-maspin細胞的遷移和侵襲，結果顯示過表達maspin明顯抑制了A549細胞的遷移和侵襲能力。同時我們檢測了uPA、uPAR、MMP9和MMP2這些與遷移和侵襲相關的蛋白，real-time PCR結果顯示，uPA、uPAR、MMP9和MMP2的mRNA表達并未受到過表達maspin的影響，并且明膠酶譜結果顯示MMP9和MMP2兩種細胞中的活性也無差異(數據未展示)。因此我們認為在A549中過表達maspin對細胞的遷移和侵襲能力的抑制與uPA、uPAR、MMP9和MMP2無相關性。

Integrin β1屬于integrins家族，由ITGB1基因編碼。Integrins在細胞表面黏附作用中起著重要作用，當配體與integrins結合使得信號由胞外傳入胞內，從而調節(jié)基因表達，細胞增殖、分化和凋亡［20］。與腫瘤微環(huán)境的相互作用對于腫瘤生長極為重要，研究表明integrin β1與腫瘤轉移密切相關。在上皮惡性腫瘤如乳腺癌和惡性膠質瘤中，發(fā)生轉移和侵襲時，integrin β1會過表達［21］。還有研究表明，integrin β1與胃癌的轉移相關，當抑制integrin β1表達時能減低胃癌的轉移［22］。在本研究中，real-time PCR結果顯示在A549細胞中過表達maspin降低了ITGB1的mRNA表達，而且Western blot結果也證實了過表達maspin抑制了integrin β1在A549中的蛋白表達。已有研究報道integrin β1與maspin、uPA 和uPAR形成復合物調節(jié)上皮細胞的黏附［23］。并且有研究證實了integrin β1通過maspin的羧基端附近有一個活性位點環(huán)與maspin直接發(fā)生相互作用［24］。因此本研究也證實了在NSCLC細胞中maspin抑制細胞遷移和侵襲與integrin β1下調有關。

綜上所述，本研究證實了盡管maspin對于NSCLC細胞A549的生長無抑制作用，但是maspin抑制了A549細胞的遷移和侵襲，并且該抑制作用與integrin β1相關。

Figure 7.Integrin β1 was involved in maspin-suppressed migration and invasion of A549 cells.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs A549-contrd.圖7 A549細胞受抑制的遷移和侵襲與整合素β1相關

［參考文獻］

［1］Silverman GA，Bird PI，Carrell RW，et al.The serpins are an expanding superfamily of structually similar but functionally diverse proteins［J］.J Biol Chem，2001，276(36) : 33293-33296.

［2］Takanami I，Abiko T，Koizumi S.Expression of maspin in non-small-cell lung cancer: correlation with clinical features［J］.Clin Lung Cancer，2008，9(6) : 361-366.

［3］Moshin SK，Zhang M，Clark GM，et al.Maspin expression in invasive breast cancer: association with other prognostic factors［J］.J Pathol，2003，199 (4) : 432-435.

［4］Guo F，Kang S，Zhou P，et al.Maspin expression is reg-ulated by the non-canonical NF-κB subunit in androgeninsensitive prostate cancer cell lines［J］.Mol Immunol，2011，49(1-2) : 8-17.

［5］劉美琴，周珺，馬亮，等.Maspin在前列腺癌PC-3細胞生物學行為中的作用［J］.中國病理生理雜志，2012，28(7) : 1202-1207.

［6］Liu J，Yin S，Reddy N，et al.Bax mediates the apoptosis-sensitizing effect of maspin［J］.Cancer Res，2004，64(5) : 1703-1711.

［7］Wojtalla A，Arcaro A.Targeting phosphoinositide 3-kinase signaling in lung cancer［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2011，80(2) : 278-290.

［8］McKenzie S，Sakamoto S，Kyprianou N.Maspin modulates prostate cancer cell apoptotic and angiogenic response to hypoxia via targeting AKT［J］.Oncogene，2008，27(57) : 7171-7179.

［9］Nam E，Park C.Maspin suppresses survival of lung cancer cells through modulation of Akt pathway［J］.Cancer Res Treat，2010，42(1) : 42-47.

［10］Sordella R，Bell DW，Haber DA，et al.Gefitinib-sensitizing EGFR mutations in lung cancer activate anti-apoptotic pathways［J］.Science，2004，305 (5687) : 1163-1167.

［11］Brognard J，Clark AS，Ni Y，et al.Akt/protein kinase B is constitutively active in non-small cell lung cancer cells and promotes cellular survival and resistance to chemotherapy and radiation［J］.Cancer Res，2001，61(10) : 3986-3997.

［12］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2008［J］.CA Cancer J Clin，2008，58(2) : 71-96.

［13］Deryugina EI，Quigley JP.Matrix metalloproteinases and tumor metastasis［J］.Cancer Metastasis Rev，2006，25 (1) : 9-34.

［14］Bodey B，Bodey B Jr，Groger AM，et al.Invasion and metastasis: the expression and significance of matrix metalloproteinases in carcinomas of the lung［J］.In Vivo，2001，15(2) : 175-180.

［15］Guo CB，Wang S，Deng C，et al.Relationship between matrix metalloproteinase 2 and lung cancer progression［J］.Mol Diagn Ther，2007，11(3) : 183-192.

［16］Biliranand H Jr，Sheng S.Pleiotrophic inhibition of pericellular urokinase-type plasminogen activator system by endogenous tumor suppressive maspin［J］.Cancer Res，2001，61(24) : 8676-8682.

［17］McGowen R，Biliran H Jr，Sager R，et al.The surface of prostate carcinoma DU145 cells mediates the inhibition of urokinase-type plasminogen activator by maspin［J］.Cancer Res，2000，60(17) : 4771-4778.

［18］Amir S，Margaryan NV，Odero-Marah V，et al.Maspin regulates hypoxia-mediated stimulation of uPA/uPAR complex in invasive breast cancer cells［J］.Cancer Biol Ther，2005，4(4) : 400-406.

［19］Yin S，Lockett J，Meng Y，et al.Maspin retards cell detachment via a novel interaction with the urokinase-type plasminogen activator/urokinase-type plasminogen activator receptor system［J］.Cancer Res，2006，66 (8) : 4173-4181.

［20］Hogg N，Patzak I，Willenbrock F.The insider’s guide to leukocyte integrin signalling and function［J］.Nat Rev Immunol，2011，11(6) : 416-426.

［21］Weaver VM，Lelièvre S，Lakins JN，et al.β4 integrindependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium［J］.Cancer Cell，2002，2 (3) : 205-216.

［22］Lin MT，Chang CC，Lin BR，et al.Elevated expression of Cyr61 enhances peritoneal dissemination of gastric cancer cells through integrin alpha2beta1［J］.J Biol Chem，2007，282(47) : 34594-34604.

［23］Endsley MP，Hu Y，Deng Y，et al.Maspin，the molecular bridge between the plasminogen activator system and β1 integrin that facilitates cell adhesion［J］.J Biol Chem，2011，286(28) : 24599-24607.

［24］Ravenhill L，Wagstaff L，Edwards DR，et al.The G-helix of maspin mediates effects on cell migration and adhesion［J］.J Biol Chem，2010，285(47) : 36285-36292.

(責任編輯:陳妙玲，羅森)

Roles of maspin in biological behaviors of A549 cells

ZHOU Jun1，ZHOU Peng1，QIN Hua-long1，2，GUO Feng1
(1Central Laboratory，2Department of Thoracic Surgery，The First Affiliated Hospital of Soochow University，Suzhou 215006，China.E-mail: guofeng27@suda.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the roles of maspin in the biological behaviors of non-small-cell lung cancer A549 cells.METHODS: Full-length coding region of maspin was amplified by PCR from human normal breast tissue and cloned into MSCV vector.Virus supernatants was produced by Phoenix A packaging system，and target cell line was infected with the virus supernatants.The transfected cells were screened with puromycin.The cell line with maspin over-expression was identified by real-time PCR and Western blot.Cell growth，migration and invasion were investigated by xCelligence system.RESULTS: Maspin over-expression vector was successfully constructed.The cell line with maspin over-expression was established.No difference of the growth between A549-control cells and A549-maspin cells was observed.The migration and invasion were quite different between A549-control cells and A549-maspin cells.The expression level of integrin β1 in A549-maspin cells was decreased compared with A549-control cells.CONCLUSION: Maspin has no effect on the growth of A549 cells.Maspin suppresses the migration and invasion of A549 cells，in which integrin β1 is involved.

［KEY WORDS］Non-small-cell lung cancer; Maspin; Cell migration; Cell invasion

通訊作者△Tel: 0512-67781270; E-mail: guofeng27@suda.edu.cn

*［基金項目］國家自然科學基金資助項目(No.81172433)

［收稿日期］2015-01-14［修回日期］2015-05-13

［文章編號］1000-4718(2015)09-1537-08

［中圖分類號］R730.23; R734.2

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.001