毛茛總苷中擴血管活性物質(zhì)實驗研究

陳新建，劉守鉀，楊智承，譚毓治

(廣東藥學(xué)院 藥科學(xué)院，廣東 廣州 510006)

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毛茛總苷中擴血管活性物質(zhì)實驗研究

陳新建，劉守鉀，楊智承，譚毓治*

(廣東藥學(xué)院 藥科學(xué)院，廣東 廣州 510006)

目的：探討毛茛總苷中總黃酮含量與其擴血管作用關(guān)系。方法：采用大鼠離體胸主動脈環(huán)張力測定方法，觀察毛茛總苷制備過程中不同濃度乙醇洗脫部位對去甲腎上腺素誘導(dǎo)的胸主動脈環(huán)收縮的抑制作用；以蘆丁為標準品，采用紫外分光光度法測定對應(yīng)各部位的總黃酮含量；以總黃酮終濃度為橫坐標，以各不同部位對抗去甲腎上腺素引起的血管環(huán)收縮的抑制率為縱坐標，進行線性回歸，分析二者相關(guān)性。結(jié)果：毛茛總苷不同部位對去甲腎上腺素誘導(dǎo)的主動脈環(huán)張力升高均有不同程度的抑制作用(P<0.05)；以總黃酮終濃度對毛茛總苷抑制去甲腎上腺素引起血管環(huán)收縮的抑制率進行線性回歸，相關(guān)系數(shù)R2=0.919 9，相關(guān)性良好。結(jié)論：毛茛總苷中總黃酮類成分可能是引起血管擴張的活性成分。

毛茛總苷；舒張血管；胸主動脈環(huán)；總黃酮; 實驗研究

毛茛(RanunculusjaponicusThunb)為毛茛科毛茛屬多年生草本植物[1]。毛茛總苷是從毛茛中提取出來的苷類成分群。采用超高效液相色譜與串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)(UPLC/Q-TOF-MS)對毛茛總苷化學(xué)成分進行分析,并對主要成分進行鑒定，結(jié)果表明，其中內(nèi)酯苷與黃酮苷為毛茛總苷的主要成分[2-3]。藥理學(xué)研究表明，毛茛總苷具有舒張動脈血管和降低血壓[4-5]、改善大鼠血流動力學(xué)[6]、抗心肌缺血[7]等作用。然而，毛茛總苷中擴血管的活性物質(zhì)尚不明確，本文為此做了一些初步探討。實驗的基本思路是：采用大鼠離體胸主動脈環(huán)對毛茛總苷不同濃度乙醇洗脫部位的擴血管作用進行測定，并以不同部位總黃酮劑量為橫坐標，擴血管藥理活性為縱坐標，對二者進行相關(guān)性分析，探討毛茛總苷中擴血管的有效組分(物質(zhì)基礎(chǔ))。

1 實驗材料

1.1 試劑

毛茛總苷制備：毛茛藥材采自江西省九江縣，由廣東藥學(xué)院劉基柱副教授鑒定為毛茛科植物毛茛。毛茛全草，曬干，切碎，用75%(φ)乙醇回流提取3次，過80目篩，合并濾液，將濃縮得到的浸膏懸經(jīng)大孔樹脂D101樹脂柱，分別用水洗(棄去)、乙醇洗脫，水浴蒸干乙醇得膏狀物即毛茛總苷。

供試品制備：取毛茛總苷適量→D101大孔樹脂柱→水洗脫至無色→分別用20%、30%、40%、50%乙醇梯度洗脫→洗脫液分別濃縮、烘干→分別稱為20%乙醇洗脫部位、30%乙醇洗脫部位、40%乙醇洗脫部位、50%乙醇洗脫部位，供實驗用。

試劑：重酒石酸去甲腎上腺素注射液(上海禾豐制藥有限公司，批號20100221，以下簡稱NE)；硝苯地平(上海華氏制藥有限公司天平制藥廠，批號96090502，以下簡稱Nif)；蘆丁標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號100080-200707)；烏拉坦(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號: T20070418)。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

生物信號采集系統(tǒng)Medlab-U/4C501型)(南京美易科技公司)、HW-1000超級恒溫器(成都泰盟科技有限公司)、UV-2550型紫外分光光度計(日本島津公司)、AUW220D電子分析天平(日本島津公司)。

1.3 動物

SPF級SD成年大鼠，體重280～320g，雌雄兼用，40只，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2008-0002，粵監(jiān)證字粵監(jiān)證字2008A020。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 毛茛總苷不同濃度乙醇洗脫部位總黃酮含量測定

按劉苑等[8]采用的紫外分光光度法測定每個供試樣品中總黃酮的含量。以蘆丁為對照品對照計算其含量。

2.2 毛茛總苷不同濃度乙醇洗脫部位對大鼠離體胸主動脈環(huán)的影響

2.2.1 胸主動脈環(huán)制備 取SD成年大鼠，處死后迅速分離出胸主動脈，置于4℃預(yù)冷的Kreb’s液(NaCl 6.9g，KCl 0.35g，MgSO4·7H2O 0.29g，KH2PO40.16g，NaHCO32.1g，CaCl20.28g，葡萄糖2.0g定容到1 000mL)中。剔除血管壁周圍脂肪和結(jié)締組織，清除管腔內(nèi)殘留積血，剪成4個等長血管環(huán)。按本實驗室前期研究方法，將修剪干凈的血管環(huán)兩端固定，用與血管內(nèi)徑相適應(yīng)的自制棉球刮除其內(nèi)膜，連續(xù)數(shù)次。血管環(huán)水平懸掛于裝有10mL Kreb’s液的37℃恒溫浴槽中，持續(xù)通入含體積分數(shù)95% O2和5% CO2的混合氣體，靜息負荷1.2g，每15min換液1次，平衡穩(wěn)定1.5h后給藥。(給藥前，可檢驗內(nèi)皮是否去除完全，加入去甲腎上腺素(NE)1μmol/L，使血管環(huán)收縮，到達平臺相后加入乙酰膽堿10μmol/L，舒張幅度不超過收縮幅度的10%時，說明去內(nèi)皮完全。否則，棄之不用)[4]。以NE(106moL/L)誘發(fā)最大收縮幅度后分別加不同乙醇洗脫部位的藥物。

2.2.2 毛茛總苷不同濃度乙醇洗脫部位對NE引起主動脈環(huán)收縮的影響 主動脈環(huán)在Kreb’s液中平衡1.5h，加入106mol/L NE，待主動脈環(huán)收縮達到坪值后再分別加入生理鹽水，毛茛總苷20%、30%、40%、50%乙醇洗脫部位(1mg/mL、2mg/mL)和硝苯地平(1μg/mL)，藥物濃度以浴槽中的終濃度表示。用預(yù)熱的Kreb’s液調(diào)整各液面相平。采用MedLab生物信號采集系統(tǒng)記錄張力變化。并按此公式計算藥物的抑制率：藥物抑制率(%) =[(F2-F3)/(F2- F1)]×100%。式中F1表示加NE前平衡的基礎(chǔ)平均張力；F2表示加106mol/L NE后張力達坪時胸主動脈環(huán)的平均張力；F3表示加入藥物后的平均張力。

2.3 毛茛總苷擴血管活性部位分析

以供試品總黃酮含量為橫坐標，供試品對NE收縮血管的抑制率為縱坐標，以供試品中總黃酮含量對其藥理效應(yīng)(抑制由去甲腎上腺素引起的血管環(huán)收縮作用，用抑制率表示)進行線性回歸。

2.4 統(tǒng)計分析

2.5 結(jié)果

2.5.1 毛茛總苷不同濃度乙醇洗脫部位中總黃酮含量測定 不同濃度乙醇洗脫部位供試品總黃酮含量測定結(jié)果為：20%、30%、40%、50%乙醇洗脫部位中總黃酮百分含量(w/w，%)分別為7.47%、20.28%、31.94%、29.82%。

2.5.2 毛茛總苷不同濃度乙醇洗脫部位對NE引起主動脈環(huán)收縮的影響 毛茛總苷中不同濃度乙醇洗脫部位對NE引起主動脈環(huán)收縮，均有不同程度的抑制作用，結(jié)果見圖1及表1。表中A、B分別為1mg/mL、2mg/mL 20%醇部位的毛茛總苷處理組；C、D分別為1mg/mL、2mg/mL 30%醇部位的毛茛總苷處理組；E、F分別為1mg/mL、2mg/mL 40%醇部位的毛茛總苷處理組；G、H分別為1mg/mL、2mg/mL 50%醇部位的毛茛總苷處理組；I為1μg/mL Nif處理組；J為生理鹽水組。與J組比較，毛茛總苷不同乙醇洗脫部位、硝苯地平組對去甲腎上腺素引起的主動脈環(huán)收縮均有不同程度的抑制作用(P<0.01)，抑制率從大到小排列為：F>E>H>I>G>D>C>B>A。

2.5.3 毛茛總苷不同濃度乙醇洗脫部位中總黃酮含量與擴血管作用相關(guān)分析 以表1中總黃酮終濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標，將A～H各組數(shù)據(jù)作圖并作直線回歸，結(jié)果見圖2。從圖2可看出，A、B、C、D、G、H各點線性關(guān)系較明顯，提示總黃酮含量與擴血管作用相關(guān)；而E、F兩點明顯偏離回歸直線，抑制作用較其他點強，E、F為40%乙醇洗脫部位的低、高劑量。此現(xiàn)象提示，毛茛總苷中擴血管作用的物質(zhì)除黃酮類成分外，可能還有其他成分，且這類成分可能主要在40%乙醇洗脫部位。

組別總黃酮終濃度(mg/L)F1F2F3抑制率(%)A74.71.244±0.0132.087±0.0201.768±0.04537.9±3.28**B149.41.254±0.0182.040±0.0301.705±0.03142.6±0.78**C2031.248±0.0362.422±0.0541.633±0.02069.0±1.87**D4061.269±0.0152.202±0.0391.415±0.01985.4±1.42**E3191.204±0.0032.218±0.0550.869±0.016133.1±2.99**F6381.266±0.0252.137±0.0140.694±0.026165.7±0.71**G2981.231±0.0222.075±0.0251.350±0.07785.9±6.47**H5961.214±0.0252.277±0.0281.045±0.055115.9±2.87**I1mg/LNif1.275±0.0322.101±0.0091.207±0.028108.2±0.71**J-1.239±0.0222.083±0.0542.091±0.013-(1.1±4.90)

注：與生理鹽水組比較，**P<0.01。

圖1 毛茛總苷不同濃度乙醇洗脫部位對NE引起大鼠主動脈環(huán)收縮的影響

圖2的回歸直線，相關(guān)系數(shù)R2=0.744 105，回歸方程為Y=0.188 51X+28.689 99，相關(guān)性并不理想。刪除E、F兩點后，其他六點重新作直線，結(jié)果見圖3。圖3的線性相關(guān)系數(shù)R2=0.919 9，回歸方程為Y=0.148 465X+30.047 56。表明相關(guān)性良好。

3 討論

本研究通過制備離體小鼠胸主動脈環(huán)來研究毛茛總苷中不同濃度乙醇洗脫部位對去甲腎上腺素引起的主動脈環(huán)收縮的抑制作用，繼而測定各不同部位黃酮類成分的含量，最后分析總黃酮含量與抑制率之間的線性關(guān)系，確定總黃酮與藥效之間的相關(guān)關(guān)系。研究結(jié)果表明，毛茛總苷中總黃酮類可能是對抗去甲腎上腺素引起的主動脈環(huán)收縮的主要成分，并提示在40%乙醇洗脫的TGRJ部位中可能還含有其他類似作用的非黃酮類活性成分，具體為何物，仍需進一步研究。

圖2 A～H各點總黃酮濃度對抑制率作直線回歸

圖3 A、B、C、D、G、H各點總黃酮濃度對抑制率作直線回歸

本研究將化學(xué)成分與藥理效應(yīng)及數(shù)學(xué)分析三者結(jié)合，在不進行分離純化的情況下，研究其活性成分或部位與藥效學(xué)之間的關(guān)系，在中草藥活性物質(zhì)研究方面，有良好的參考價值和應(yīng)用價值。

黃酮類化合物泛指兩個具有酚羥基的苯環(huán)(A-與B-環(huán))通過中央三碳原子相互連結(jié)而成的一系列化合物，其基本母核為2-苯基色原酮。黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中常連接有酚羥基、甲氧基、甲基、異戊烯基等官能團。此外，它還常與糖結(jié)合成苷。黃酮類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于自然植物中,以游離態(tài)或與糖結(jié)合為苷的形式存在，不僅種類繁多，而且結(jié)構(gòu)類型復(fù)雜多樣，表現(xiàn)出多種多樣的藥理活性，能防治心腦血管系統(tǒng)疾病和呼吸系統(tǒng)疾病，具有抗炎抑菌、降血糖、抗氧化，抗輻射、抗癌、抗腫瘤以及增強免疫力等藥理作用[9]。有研究表明，黃酮類化合物具有擴張血管的作用，主要表現(xiàn)在可以改善心肌平滑肌的收縮舒張功能，其作用機制與黃酮類化合物調(diào)節(jié)平滑肌細胞外Ca2+內(nèi)流和細胞內(nèi)Ca2+釋放有關(guān)。甲基黃酮醇胺鹽酸鹽的研究也表明其有抗實驗性心律失常、實驗性心肌梗塞和實驗性血栓形成的作用，可以抑制鉀鈣引起的兔主動脈條及平滑肌收縮[10]。本實驗研究表明，毛茛總苷中擴張血管的活性物質(zhì)可能是黃酮類物質(zhì)，為黃酮類物質(zhì)擴血管作用提供了新的實驗依據(jù)。

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(責任編輯：宋勇剛)

Experimental Study on the Active Substance of Expanding Vessel From Total Glycosides ofRanunculusJaponiucus

Chen Xinjian, Liu Shoujia, Yang Zhicheng, Tan Yuzhi*

(Guangdong Pharmaceutical University of Pharmacy College, Guangzhou 510006,China)

Objective:To study the relation between the total flavonoid content from the total glycosides of ranunculus japoniucus and its function of expanding vessel.Methods:Observed the inhibition effect of different parts of total glycosides of ranunculus japoniucus on contraction of thoracic aortic induced by norepinephrine (NE) with the method of determining the tension of the thoracic aortic rings in vitro on the test rats .Measured the total flavonoid content in different parts of total glycosides of ranunculus japoniucus by UV spectrophotometry ,and the Rutin was used to be the standard. Created the regression curve by using the total flavonoid contents as the abscissa and the inhibition rates of the different parts of total glycosides of ranunculus japoniucus against the vessel loop as the vertical coordinate,and investigated the correlation regression between the above two by Logistic and linear statistics.Results:The different alcohol part of total glycosides of ranunculus japoniucus can restrain the increaseing of the thoracic aortic tension on different degrees which induced by norepinephrine (P<0.05). Investigated the correlation regression between the total flavonoid content and the inhibition rates of total glycosides of ranunculus japoniucus restraining the contraction of the vessel loop induced by norepinephrine (NE),and the correlation coefficient is 0.919 9,which shows a good correlation.Conclusion:The flavonoid in total glycosides of ranunculus japoniucus glycosides might be the active components that result in the vasodilatation.

The Total Glycosides ofRanunculusjaponiucusThunb; Vasodilatation Reconstruction of Cardiovascular ; Thoracic Aortic Ring ; Total Flavonoid; Experimental Study

2014-09-19

國家自然科學(xué)基金項目(81073141)

陳新建(1988-)，男，廣東藥學(xué)院碩士研究生，研究方向為新藥篩選及作用機制。

譚毓治(1956-)，男，廣東藥學(xué)院教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為新藥篩選及作用機制。

R285.5

A

1673-2197(2015)03-0011-03

10.11954/ytctyy.201503005