正交試驗(yàn)優(yōu)選鹽酸水解提取荷葉總黃酮醇苷工藝

鄒佳峰,吳 瑤

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué),浙江 杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司,浙江 杭州 311401)

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正交試驗(yàn)優(yōu)選鹽酸水解提取荷葉總黃酮醇苷工藝

鄒佳峰1,吳 瑤2

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué),浙江 杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司,浙江 杭州 311401)

目的：利用甲醇-鹽酸水解法從荷葉中提取總黃酮醇苷。方法：利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選總黃酮醇苷最佳提取工藝，考察鹽酸濃度、水解時間及水解溫度對總黃酮醇苷得率的影響。結(jié)果：總黃酮醇苷最佳提取工藝為：10%鹽酸甲醇溶液在80℃條件下水解120min，總黃酮醇苷含量為32.53mg/g。結(jié)論：甲醇-鹽酸水解法可用于荷葉中總黃酮的提取，其中水解溫度對總黃酮醇苷的提取影響較大。

總黃酮醇苷；荷葉；正交試驗(yàn)；提取工藝

荷葉系睡蓮科蓮屬植物蓮NelumbonuciferaGaertn.的干燥葉[1]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為荷葉性味苦寒，具有清暑利濕、生發(fā)清陽、清心去熱、止血利水的功效[1]，研究表明荷葉具有抗氧化[2]、降血脂[3]、抑菌[4,5]、抗病毒等作用?？傸S酮醇苷作為一類重要活性物質(zhì)具有抑制血小板活化因子[6]、改善人體心腦血液循環(huán)[7]、增強(qiáng)肌體免疫功能[8]、清除氧自由基、抗病毒[8]等作用。此前，對銀杏葉總黃酮醇苷有較多的研究，且開發(fā)出了一系列相關(guān)產(chǎn)品，但對荷葉總黃酮醇苷及其相關(guān)產(chǎn)品研究較少。

鑒于此，在前期水提鹽酸水解和醇提[9]的基礎(chǔ)上，以鹽酸甲醇為溶劑，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)對鹽酸濃度、水解時間及水解溫度進(jìn)行優(yōu)化篩選，獲取最佳提取工藝。

本文參考有關(guān)文獻(xiàn)資料[1,11]，采用以槲皮素、山柰素、異鼠李素為對照，計(jì)算總黃酮醇苷的含量，公式為：總黃酮醇苷含量=(槲皮素含量+山柰素含量+異鼠李素含量)×2.51。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

Ultimate3 000型高效液相色譜儀(美國戴安公司)；Agilent Eclipse XDB-C18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱，R-201恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司)；BP210S十萬分之一電子天平(Sartorius公司)；真空干燥箱DZF-6021型(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥

荷葉(批號：HY-20140419)，產(chǎn)地湖北，購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司；槲皮素(批號：100081-200907，含量96.5%)、山柰素(批號：110861-201209，93.2%)、異鼠李素(批號：110860-200407)購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，水為重蒸水。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

以Agilent Eclipse XDB-C18(4.6mm×250mm,5μm)為色譜柱，甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)為流動相，檢測波長為360nm，流速為1.0mL/min，柱溫為25℃，該條件下，樣品中各待測組分與其相鄰色譜峰得到基線分離[10,11]，見圖1。

圖1 總黃酮醇苷類成分槲皮素、山柰素和異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品及荷葉樣品色譜

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

分別精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品槲皮素3.78mg、山柰素2.84mg、異鼠李素3.12mg于10mL容量瓶中，加甲醇10mL溶解，搖勻制成儲備液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品槲皮素、山柰素、異鼠李素儲備液依次稀釋成各濃度的對照品溶液：槲皮素14.59、29.18、58.36、116.72、233.44μg/mL；山柰素10.59、21.18、42.36、84.72、169.44μg/mL；異鼠李素12.48、24.96、49.92、99.84、199.68μg/mL，待測。

2.3 供試品溶液制備

稱取荷葉粉末約0.1g，加入10%鹽酸甲醇溶液20mL，在80℃條件下水解120min。過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 精密度考察

精密吸取槲皮素58.36μg/mL、山柰素42.36μg/mL、異鼠李素49.92μg/mL的對照品溶液，重復(fù)測定6次，槲皮素、山柰素和異鼠李素峰面積的RSD分別為0.486%、0.372%和0.738%，表明儀器精密度良好。

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2”項(xiàng)下稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在“2.1”色譜條件下進(jìn)行分析，以對照品進(jìn)樣量(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：槲皮素Y=0.468 9X+0.333 3，r=0.999 8；山柰素Y=0.458 2X+0.125 0，r=0.999 9；異鼠李素Y=0.487 7X-1.045 8,r=0.999 8，表明對照品槲皮素在14.59～233.44μg/mL、山柰素在10.59～169.44μg/mL、異鼠李素在12.48～199.68μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.6 準(zhǔn)確度考察

稱取同一批次荷葉粉6份，每份約0.1g，加入槲皮素0.365mg/g 2mL、山柰素21.18μg/mL 1mL、異鼠李素49.92μg/mL 1mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并進(jìn)樣分析。計(jì)算槲皮素、山柰素和異鼠李素的加樣回收率分別為99.79%(RSD=1.79%)、98.82%(RSD=2.14%)和98.38%(RSD=2.46%)，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.7 穩(wěn)定性考察

取供試品溶液，分別放置0、6、12、18、24h后進(jìn)樣測定，計(jì)算得槲皮素、山柰素和異鼠李素峰面積的RSD分別為0.792%、1.537%和1.328%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 單因素試驗(yàn)

2.8.1 鹽酸濃度考察 以鹽酸甲醇為提取溶劑，稱取荷葉粉末約0.1g，加入20mL溶劑，其中鹽酸濃度分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%，在80℃條件下水解90min。槲皮素、山柰素、異鼠李素及總黃酮醇苷含量見表1。

表1 鹽酸濃度對黃酮類成分提取的影響

2.8.2 水解時間考察 以鹽酸甲醇為提取溶劑，稱取荷葉粉末約0.1g，加入20mL溶劑，其中鹽酸濃度為8%，在80℃條件下分別水解15、30、60、90、120、150min。槲皮素、山柰素、異鼠李素及總黃酮醇苷含量見表2。

2.8.3 水解溫度考察 以鹽酸甲醇為提取溶劑，稱取荷葉粉末約0.1g，加入20mL溶劑，其中鹽酸濃度為8%，分別在50、60、70、80、90、100℃下水解90min。槲皮素、山柰素、異鼠李素及總黃酮醇苷含量見表3。

由上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在不同鹽酸濃度、水解時間和水解溫度下，荷葉總黃酮醇苷得率有明顯的差異，且黃酮類成分槲皮素、山柰素、異鼠李素在不同條件下有相應(yīng)的差異。故試驗(yàn)篩選3個因素各3個水平，以總黃酮醇苷為評價指標(biāo)對提取工藝進(jìn)行正交優(yōu)化。

表2 水解時間對黃酮類成分提取的影響

表3 水解溫度對黃酮類成分提取的影響

2.9 正交試驗(yàn)

2.9.1 試驗(yàn)因素與水平 在上述鹽酸濃度、水解時間和水解溫度單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)置 L9(34)正交試驗(yàn)，其中影響因素和水平見表4。

表4 影響因素和水平

2.9.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 由試驗(yàn)結(jié)果表5和方差分析表6可看出，三種因素及其水平對總黃酮醇苷提取量的影響是不同的：正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，各因素作用主次為C>A>B；方差分析結(jié)果表明，因素A和C均具有顯著性差異，而水解溫度C較于鹽酸濃度A對荷葉的總黃酮醇苷的提取有更大的影響。故試驗(yàn)以A2B2C2組合為佳，即以鹽酸甲醇為提取溶劑，鹽酸濃度為10%在80℃條件下水解120min為最佳提取工藝。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 方差分析

2.10 樣品分析

取相同批次荷葉樣品，精密稱取粉末約0.1g，共5份，用上述最佳條件進(jìn)行提取和測定，分析結(jié)果見表7。

表7 荷葉總黃酮醇苷含量測定

3 討論

荷葉的活性成分是以荷葉堿為主的生物堿類化合物，已有較多的研究?？傸S酮醇苷作為一類重要的黃酮類化合物，在荷葉中占有相當(dāng)大的比重。近些年來，關(guān)于銀杏總黃酮醇苷的研究報道較多，并開發(fā)出了如銀曲膠囊、心腦舒通等醫(yī)療保健品。我國荷葉資源豐富，而相應(yīng)的醫(yī)療保健產(chǎn)品開發(fā)甚少。鑒于此，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，對荷葉總黃酮醇苷的提取工藝進(jìn)行研究，以獲取簡便、可行、高效的提取方法。

通過正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析可知，水解溫度在荷葉總黃酮醇苷水解提取過程中影響最為顯著，鹽酸濃度次之。結(jié)合驗(yàn)證與比較試驗(yàn)，確定最佳工藝為A2B2C2，即以鹽酸甲醇為提取溶劑，鹽酸濃度為10%在80℃條件下水解120min。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010：258.

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(責(zé)任編輯：魏 曉)

Optimization of Hydrochloric Acid Hydrolysis Extracting Total Flavonoid Glycoside from Lotus Leafs by Orthogonal Test

Zou Jiafeng1,Wu Yao2

(1.Zhejiang Chinese medical University,Hangzhou 310053，China;2.Zhejiang Chinese medical University mecical pieces,.LTD,Hangzhou 311401，China)

Objective:To optimize the extraction process of Total Flavonoid Glycoside from Lotus Leafs.Methods:The Total Flavonoid Glycoside was extracted using hydrochloric acid hydrolysis,and the extract rate of Total Flavonoid Glycoside was studied by hydrochloric acid concentration of extraction,the hydrolysis of time of extraction,the hydrolysis of temperature of extraction.Results:The optimum extracting technology were as follows:with hydrochloric acid concentration is 10%,time of extracting is 120 min,temperature of extracting is 80℃.The extract rate of Total Flavonoid Glycoside is 32.53mg/g.Conclusion:The method of hydrochloric acid hydrolysis were uesed extracting Total Flavonoid Glycoside is possibly,and the significantly factor is extract temperature.

Total Flavonoid Glycoside; Lotus Leafs; Orthogonal Test Design； Extracting Technology

2015-03-03

鄒佳峰(1994-)，男，浙江中醫(yī)藥大學(xué)在讀生，研究方向?yàn)橹兴帉W(xué)。

R284

A

1673-2197(2015)13-0019-03

10.11954/ytctyy.201513008