管美玉,劉玉強(qiáng),才 謙,劉禹彤,曾申磊
(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,遼寧 大連 116600)
?
無(wú)梗五加果實(shí)抗疲勞活性研究
管美玉,劉玉強(qiáng),才 謙*,劉禹彤,曾申磊
(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,遼寧 大連 116600)
目的:研究無(wú)梗五加果實(shí)各提取物的抗疲勞作用,為無(wú)梗五加的廣泛應(yīng)用提供依據(jù)。方法:采用小鼠力竭游泳實(shí)驗(yàn),考察連續(xù)灌胃無(wú)梗五加果實(shí)提取物2周對(duì)小鼠抗疲勞能力的影響,并對(duì)給藥后小鼠體內(nèi)血乳酸、血尿素氮、肝糖原和肌糖原的變化進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果:無(wú)梗五加果實(shí)提取物能夠延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間、降低小鼠運(yùn)動(dòng)后的乳酸堆積和血尿氮的生成,增加肝糖原、肌糖原的儲(chǔ)備量。結(jié)論:無(wú)梗五加果實(shí)具有抗疲勞作用,尤以無(wú)梗五加果實(shí)醇提物抗疲勞作用最顯著。
抗疲勞;無(wú)梗五加果實(shí);血乳酸;血尿素氮;肝糖原;肌糖原
無(wú)梗五加[Acanthopanaxsessiliflorus(Ruqr.et Maxim)Seem.]又名短梗五加、烏鴉子,主要分布于東北、華北、陜西等地,與刺五加同為五加科(Araliaceae)五加屬植物,刺五加具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老功效[1]。并且同科屬植物藥理作用有很多相似之處,馮穎等[2]曾在研究中提到無(wú)梗五加果實(shí)多糖具有抗疲勞作用,但對(duì)無(wú)梗五加果實(shí)醇提物抗疲勞作用缺乏研究,本研究采用小鼠力竭游泳實(shí)驗(yàn)分別對(duì)無(wú)梗五加果實(shí)乙醇提取物和2種不同提取方法所得到的多糖的抗疲勞活性進(jìn)行了研究,初步明確無(wú)梗五加果實(shí)抗疲勞作用及其作用機(jī)理,為無(wú)梗五加果實(shí)抗疲勞的藥理作用的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。
1.1 試藥
無(wú)梗五加果實(shí)購(gòu)自遼寧省丹東農(nóng)業(yè)科學(xué)院,由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室王冰教授鑒定為Acanthopanaxsessiliflorus(Ruqr.et Maxim)Seem.的干燥果實(shí)。1,6-二磷酸果糖購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司(批號(hào):20130921)。
1.2 動(dòng)物
昆明種小鼠,SPF級(jí),體重18~22g,雄性,由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供,許可證號(hào):SCXK(遼)2010-0001 。
1.3 儀器和試劑
RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);酶標(biāo)儀(DNM9602G型號(hào),北京普朗公司);萬(wàn)分之一克電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公);低溫冷凍離心機(jī)(TGL-16,大連松譜瑞特貿(mào)易公司)冷凍干燥機(jī)(LGJ-10壓蓋型,北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津泰斯特儀器有限公司)。尿素氮試劑盒購(gòu)自上海科興商貿(mào)有限公司(批號(hào):201409);血乳酸試劑盒購(gòu)自上海科興商貿(mào)有限公司(批號(hào):201409);肝糖原試劑盒購(gòu)自上??婆d商貿(mào)有限公司(批號(hào):201409);肌糖原試劑盒購(gòu)自上??婆d商貿(mào)有限公司(批號(hào):201409)。
2.1 無(wú)梗五加果實(shí)各提取物制備
2.1.1 乙醇提取物制備 干燥的無(wú)梗五加果實(shí)粉末,加80%乙醇回流提取3次,每次2h,過(guò)濾,合并提取液,濃縮至1.25g/mL,1mL無(wú)梗五加果實(shí)乙醇提取液相當(dāng)于1.25g生藥。
2.1.2 多糖1制備 醇提后的果實(shí)殘?jiān)匀涣栏珊?,?0倍的水進(jìn)行回流提取3次,每次2h,合并提取液,濾過(guò),濾液減壓濃縮至250mL,加入一定量95%乙醇使含醇量達(dá)到80%,靜置放置24h,除去上層溶液,留下層多糖沉淀,然后將下層沉淀濃縮一定程度后進(jìn)行冷凍干燥,得棕色的無(wú)梗五加多糖1,1g多糖1相當(dāng)于14.58g生藥。
2.1.3 多糖2制備 干燥的無(wú)梗五加果實(shí)粉末,以10倍量水進(jìn)行回流提取3次,每次2h,合并提取液,濾過(guò)、減壓濃縮至600mL,加入一定量95%乙醇使含醇量達(dá)到80%,靜置放置24h,除去上層溶液留下層多糖沉淀,然后將下層沉淀濃縮一定程度后進(jìn)行冷凍干燥,得棕色的無(wú)梗五加多糖2,1g多糖2相當(dāng)于11.90g生藥。
2.2 動(dòng)物分組與給藥
將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為8組,每組10只,分別為空白組(蒸餾水),陽(yáng)性對(duì)照組(1,6-二磷酸果糖0.5g/(mL·d)),無(wú)梗五加果實(shí)醇提物高劑量組(0.58g/(mL·d))、無(wú)梗五加果實(shí)醇提物低劑量組(0.29g/(mL·d))、多糖1高劑量組(800mg/(kg·d))、多糖1低劑量組(400mg/(kg·d))、多糖2高劑量組(980mg/(kg·d))、多糖2低劑量組(490mg/(kg·d)),給藥體積為0.2mL/(10g·d),給藥方式均為灌胃給藥,并且保證給藥各組生藥量相等(陽(yáng)性組除外),每日給藥1次,連續(xù)給藥2周。
2.3 測(cè)定指標(biāo)
2.3.1 力竭游泳實(shí)驗(yàn)[3-4]末次給藥30min后,將小鼠尾巴系上一塊質(zhì)量為2g的鉛塊,將小鼠置于水深30cm的游泳箱中,水溫控制在(25±2)℃左右,強(qiáng)迫小鼠游泳直到力竭,以小鼠全身沒(méi)于水面以下,8s內(nèi)不能浮出水面即為力竭,記錄開(kāi)始游泳至力竭的時(shí)間,為小鼠力竭游泳時(shí)間,計(jì)算給藥后各組小鼠平均游泳時(shí)間。
2.3.2 血乳酸(LAC)和血清尿素氮(BUN)的含量測(cè)定 末次給藥30min后,將小鼠尾巴系上一塊質(zhì)量為2g的鉛塊,將小鼠置于水深30cm的游泳箱中,水溫控制在(25±2)℃左右,游泳30min,出水休息30min 后立即摘眼球取血,4℃下靜置1h后,5 000r·min-1離心15min,取血清,按ELISA試劑盒要求測(cè)定小鼠給藥后血清BUN、LAC的含量。
2.3.3 肝糖原和肌糖原的含量測(cè)定[5]同“2.3.2”操作,出水休息30min后立即脫頸椎處死,取肝臟和大腿肌肉并用生理鹽水清洗后,用濾紙吸干,分別稱(chēng)取小鼠肝臟和大腿肌肉約60mg,加入一定量的PBS(PH 7.4),用勻漿器將標(biāo)本勻漿化,離心20min左右(2 000~3 000r·min-1)。仔細(xì)收集上清液,按照ELISA試劑盒要求測(cè)定小鼠給藥后肝糖原、肌糖原的含量。
2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
3.1 無(wú)梗五加果實(shí)各提取物對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響
與空白組比較無(wú)梗五加果實(shí)醇提物、多糖1、多糖2、陽(yáng)性藥均能延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間,其中醇提物高劑量組、多糖2高低劑量組、陽(yáng)性藥組能顯著延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見(jiàn)表1。
表1 無(wú)梗五加果實(shí)各提取物對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響
注:與空白組比較,*P<0.05。
3.2 無(wú)梗五加果實(shí)各提取物對(duì)小鼠體內(nèi)血乳酸和血尿素氮水平的影響
與空白組比較無(wú)梗五加果實(shí)醇提物高低劑量組、多糖1高低劑量組、多糖2高低劑量組、陽(yáng)性藥組均能顯著降低小鼠運(yùn)動(dòng)后乳酸的積累量和降低小鼠運(yùn)動(dòng)后血尿素氮的生成,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見(jiàn)表2。
3.3 無(wú)梗五加果實(shí)各提取物對(duì)小鼠體內(nèi)肝糖原、肌糖原的影響
與空白組比較,無(wú)梗五加果實(shí)醇提物高低劑量組、多糖1高低劑量組、多糖2高低劑量組、陽(yáng)性藥組均能增加小鼠運(yùn)動(dòng)后體內(nèi)肝糖原、肌糖原的儲(chǔ)備量。其中無(wú)梗五加果實(shí)醇提物高劑量組、無(wú)梗五加果實(shí)多糖2高劑量組及陽(yáng)性藥組能極顯著同時(shí)增加小鼠運(yùn)動(dòng)后體內(nèi)肝糖原、肌糖原的儲(chǔ)備量(P<0.01),具體數(shù)值見(jiàn)表3。
表2 無(wú)梗五加果實(shí)各提取物對(duì)血乳酸和血尿素氮的影響
注:與空白組比較,*P<0.05。
表3 無(wú)梗五加果實(shí)提取物對(duì)肝糖原、肌糖原的影響
注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01。
疲勞是由運(yùn)動(dòng)引起的機(jī)體一系列生化指標(biāo)改變而導(dǎo)致的肌肉力量的降低。傳統(tǒng)對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞產(chǎn)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)主要在于能量耗竭學(xué)說(shuō)、代謝產(chǎn)物堆積學(xué)說(shuō)、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失調(diào)學(xué)說(shuō)、機(jī)體突變理論、神經(jīng)疲勞學(xué)說(shuō)和自由基學(xué)說(shuō)[6],因此對(duì)疲勞的評(píng)價(jià)方法應(yīng)以耐力實(shí)驗(yàn)和生化指標(biāo)為主。耐力實(shí)驗(yàn)主要包括運(yùn)動(dòng)跑臺(tái)、爬桿和游泳[7]。生化指標(biāo)包括血乳酸、血尿素氮、肝糖原、肌糖原等。根據(jù)1996年頒布的《保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢測(cè)方法》,如果14項(xiàng)或1項(xiàng)以上的耐力運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)(負(fù)重游泳和爬桿試驗(yàn))和2項(xiàng)或2項(xiàng)以上的生化指標(biāo)(血乳酸、血清尿素氮、肝糖原、肌糖原等)結(jié)果呈陽(yáng)性,就可以得出受試藥物具有抗疲勞活性。
本實(shí)驗(yàn)主要考察的是負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)、血乳酸、血尿素氮、肝糖原、肌糖原5項(xiàng)指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn),無(wú)梗五加果實(shí)各提取物能延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間、降低小鼠運(yùn)動(dòng)后的乳酸堆積和血尿氮的生成、增加肝糖原、肌糖原的儲(chǔ)備量,其中以無(wú)梗五加果實(shí)醇提物抗疲勞作用最顯著。但對(duì)于抗疲勞的機(jī)制尚不明確,有待進(jìn)一步深入研究。
[1] 王祥.中藥刺五加藥理作用的研究進(jìn)展[J].求醫(yī)問(wèn)藥,2012,10(5):320-321.
[2] 馮穎,孟憲軍,王建國(guó),等.無(wú)梗五加果多糖組成及生物活性的研究[J].食品科學(xué),2008,29(4):378-380.
[3] 張穎,張立木,李同德,等.紫荊葉對(duì)模型小鼠的消炎鎮(zhèn)痛及耐缺氧抗疲勞作用的研究[J].中國(guó)藥房,2009,20(36):2817.
[4] 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué) [M]. 第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2006:717.
[5] 叢登立,王浩天,高笑一,等.刺五加果的抗疲勞作用[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào),2010,36(5):891-893.
[6] 李曉莉,王斌,劉架麟.枸杞多糖對(duì)小鼠耐常壓缺氧能力的影響[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2000(4):337-340.
[7] BONGIOVANNI,LGANDHAGBARTH,K-E.Tonic vibration reflexes elicited during fatigue from maximal voluntary contractions in man [J].Journal of Physiology Online,1990,423(1):1-14.
(責(zé)任編輯:宋勇剛)
Study on the Anti-fatigue Effect of Acanthopanax Sessiliflorus Fruits
Guan Meiyu,Liu Yuqiang,Cai Qian*,Liu Yutong,Zeng Shenlei
(College of Pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China)
Objective:To study on the anti-fatigue effect of the extract of Acanthopanax sessiliflorus fruits,to provide the basis for the wide application of Acanthopanax sessiliflorus.Methods:Exhaustive swimming test were employed to evaluate anti-fatigue effect of extracts of Acanthopanax sessiliflorus fruits in mice,extract orally administraded for two weekends consecutively.Further,lactic acid level and urea nitrogen level were examined,and hepatic gly-Cogen and muscle glycogen level after swimming were determined.Results:The extract of Acanthopanax sessiliflorus fruits extended swimming time,lactic acid level and urea nitrogen level were decrease-d,hepatic glycogen and muscle glycogen level were increased after Treatment.Conclusion:Acanthopanax sessiliflorus fruits have obvious anti-fatigue effects.the alcohol extract the of Acanthopanax sessiliflorus fruits showed more remarkable anti- fatigue.
Anti-fatigue;Acanthopanax Sessiliflorus Fruits; Blood Lactic Acid;Blood Urea Nitrogen;Hepatic Glycogen;Muscle Glycogen
2015-04-17
管美玉(1989-),女,遼寧中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生,研究方向?yàn)橹兴幓瘜W(xué)。
才謙(1972-),女,遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教授,研究方向?yàn)橹兴幓瘜W(xué)和中藥炮制學(xué)。E-mail:caiqianmail@sina.com
R285.5
A
1673-2197(2015)19-0010-03
10.11954/ytctyy.201519005