百寶丹噴霧劑微生物限度檢查方法學驗證

趙加強,周榮光,*,楊兆祥,李翠娥，高宏濤

(1.昆明制藥集團股份有限公司，云南 昆明 650100； 2.昆明醫(yī)科大學，云南 昆明 650500)

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百寶丹噴霧劑微生物限度檢查方法學驗證

趙加強1,周榮光1,2*,楊兆祥1,李翠娥2，高宏濤1

(1.昆明制藥集團股份有限公司，云南 昆明 650100； 2.昆明醫(yī)科大學，云南 昆明 650500)

目的：建立百寶丹噴霧劑的微生物限度檢查方法。方法：按照《中國藥典》2010版要求 ，采用常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法對具有代表性的細菌、霉菌、酵母菌進行回收率測定,并對控制菌檢查法進行方法學驗證。結果：采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2mL/皿)，5種試驗菌的回收率均大于70%；采用培養(yǎng)基稀釋法(供試液10mL+增菌培養(yǎng)基800mL)檢查金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，試驗組和陽性對照組呈陽性反應，陰性菌對照組呈陰性反應。結論：可采用培養(yǎng)基稀釋法對百寶丹噴霧劑進行微生物限度檢查。

百寶丹噴霧劑；微生物限度檢查；方法學驗證

百寶丹噴霧劑是以曲煥章先生創(chuàng)制的百寶丹散劑為基礎，結合現(xiàn)代制劑手段和技術研制而成的新型外用制劑，具有良好的鎮(zhèn)痛抗炎作用[1]。《中國藥典》2010版規(guī)定，口服、外用藥品的微生物限度檢查，應進行細菌 、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證 ，以確認所用的方法適合該產(chǎn)品的檢測。而對具有抑菌作用的產(chǎn)品，由于在試驗條件下存在對待檢菌的干擾，必須采取適當?shù)姆椒ㄏ驕p弱供試品的抑菌活性，從而順利檢出供試品所污染的各種微生物。本文旨在按照中國藥典的要求 ，建立百寶丹噴霧劑的微生物限度檢查方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HTY-2000A集菌儀(杭州高得醫(yī)療器械有限公司)；開放式集菌器(北京牛牛基因技術有限公司)；303-6B隔水式恒溫培養(yǎng)箱(南通科學儀器廠)；霉菌培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 供試樣品

百寶丹噴霧劑(批號：20140804、20140805、20140806，昆明制藥集團股份有限公司藥物研究院)。

1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號：111222)、改良馬丁液體培養(yǎng)基(批號：120410)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號：120416)、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基(批號：120319)、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號：120207)、膽鹽乳糖培養(yǎng)基(批號：120322)均由北京三藥科技開發(fā)公司提供。甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基(批號：20130918)、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基(批號：20140305)均由青島日水生物科技有限公司提供。

1.4 菌種

白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillusniger) [CMCC(F)98003]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]、大腸埃希菌(Escherichiacoli) [CMCC(F)44102]均由中國食品藥品檢定研究院提供。

2 實驗方法

2.1 菌液制備

接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，于24～26℃培養(yǎng)48h，用0.9%的無菌氯化鈉溶液稀釋，制成1mL含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液備用。

接種枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于32～35℃培養(yǎng)24h，用0.9%的無菌氯化鈉溶液稀釋，制成1mL含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液備用。

接種黑曲霉菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，于24～26℃培養(yǎng)5d，用5mL 0.9%的無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫，洗脫液用5mL 0.9%的無菌氯化鈉溶液稀釋，制成1mL含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液備用。

2.2 供試液制備

取供試樣品10mL，加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，混勻，制成1∶10供試液備用。

2.3 菌落計數(shù)方法及驗證

2.3.1 菌落計數(shù)方法 采用常規(guī)法(1mL/皿)和培養(yǎng)基稀釋法(0.2mL/皿)對細菌、霉菌及酵母菌進行菌落計數(shù)，通過回收率測定進行方法學驗證[2]。

2.3.2 回收率測定 試驗組：取1∶10供試液1mL、含50～100cfu試驗菌的菌液1mL加入平皿中，5種試驗菌每種菌平行制備2個平皿。在加有枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌菌液的平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基20mL，待凝固后，于30～35℃培養(yǎng)72h，觀察記錄菌落數(shù)；在加有黑曲霉菌、白色念珠菌菌液的平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基20mL，待凝固后，于23～28℃培養(yǎng)120h，觀察記錄菌落數(shù)。菌液組：取含50～100cfu試驗菌的菌液1mL加入平皿中，5種試驗菌每種菌平行制備2個平皿。其余操作同試驗組。供試品對照組：取1∶10供試液1mL加入平皿中，共制備4個平皿。在2個平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基20mL，待凝固后，于30～35℃培養(yǎng)72h，觀察記錄菌落數(shù)；在另外2個平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基20mL，待凝固后，于23～28℃培養(yǎng)120h，觀察記錄菌落數(shù)?；厥章视嬎惴椒ǎ涸囼灲M的菌回收率(%)=(試驗組菌落數(shù)平均值-供試品對照組菌落數(shù)平均值)/菌液組菌落數(shù)平均值×100%。

2.3.3 培養(yǎng)基稀釋法回收率測定 試驗組：取1∶10供試液0.2mL、含50～100cfu試驗菌的菌液1 mL加入平皿中。其余操作同常規(guī)法。菌液組：同常規(guī)法。供試品對照組：取1∶10供試液0.2mL加入平皿中，共制備4個平皿。其余操作同常規(guī)法。回收率計算方法同常規(guī)法。

2.4 控制菌檢查方法及驗證

2.4.1 金黃色葡萄球菌檢查方法及驗證 試驗組：取供試液10mL、含50～100cfu金黃色葡萄球菌的菌液1mL各3份，分別加入100、500、800mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于30～35℃培養(yǎng)24h。

陽性對照組：取含50～100cfu金黃色葡萄球菌的菌液1mL各3份，分別加入100、500、800mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于30～35℃培養(yǎng)24h。

陰性菌對照組：取供試液10mL、含50～100cfu大腸埃希菌的菌液1mL各3份，分別加入100、500、800mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于30～35℃培養(yǎng)24h。

供試品組：取供試液10mL各3份，分別加入100、500、800mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于30～35℃培養(yǎng)24h。

金黃色葡萄球菌檢查方法：取上述營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液1mL，劃線接種在甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)24h后觀察結果。

2.4.2 銅綠假單胞菌檢查方法及驗證 試驗組：取供試液10mL、含50～100cfu銅綠假單胞菌的菌液1mL各3份，分別加入100、500 、800mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，于30～35℃培養(yǎng)24h。

陽性對照組：取含50～100 cfu銅綠假單胞菌的菌液1mL各3份，分別加入100mL、500mL 、800mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，于30～35℃培養(yǎng)24 h。

陰性菌對照組：取供試液10mL、含50～100 cfu金黃色葡萄球菌的菌液1mL各3份，分別加入100、500、800mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，于30～35℃培養(yǎng)24h。

供試品組：取供試液10mL各3份，分別加入100、500、800mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，于30～35℃培養(yǎng)24h。

銅綠假單胞菌檢查方法：取上述膽鹽乳糖培養(yǎng)物1mL，劃線接種在溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)24h后觀察結果。

3 實驗結果

3.1 菌落計數(shù)方法

由表1可見，百寶丹噴霧劑對枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉菌均有較強作用，常規(guī)法(1mL/皿)不適用上述5種菌株的菌落計數(shù)；采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2mL/皿)，能有效消除或減弱百寶丹噴霧劑的抑菌活性，使5種試驗菌的回收率均達到70%以上。

3.2 控制菌檢查方法

從表2可以看出， 采用供試液10mL+增菌培養(yǎng)基100 mL的常規(guī)法以及供試液10mL+增菌培養(yǎng)基500mL的培養(yǎng)基稀釋法，均不能有效檢出試驗組中的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌；而供試液10mL+增菌培養(yǎng)基800mL的培養(yǎng)基稀釋法能同時檢出試驗組和陽性對照組中的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，適用于百寶丹噴霧劑控制菌的檢查。

4 討論

百寶丹噴霧劑系采用三七、滇草烏、金鐵鎖和重樓的乙醇提取物外加增溶劑、乳化劑、滲透劑等制成的新型外用制劑，這些藥物和助劑成分對微生物具有一定的抑制作用，如已有研究表明，重樓對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等細菌和真菌具有較強的抑制作用[3-4]。由于這些成分的存在，對百寶丹噴霧劑中污染的微生物造成不同程度的抑制，但當生存環(huán)境如抑菌濃度等發(fā)生變化時，這些微生物便可復蘇繁殖，造成產(chǎn)品質量問題，危害人體健康。因此，在對百寶丹噴霧劑進行微生物檢查時，必須采取適當?shù)姆椒ㄏ驕p弱其抑菌活性，建立一種適合該產(chǎn)品的微生物檢查方法。

本研究表明，采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2mL/皿)能有效消除百寶丹噴霧劑對枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉菌的抑菌活性，使5種試驗菌的回收率均達到70%以上；供試液10mL+增菌培養(yǎng)基800mL的培養(yǎng)基稀釋法能同時檢出試驗組和陽性對照組中的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，適合于百寶丹噴霧劑控制菌的檢查。

表1 回收率測定結果 (%)

表2 控制菌檢查方法的驗證

[1] 周榮光,楊兆祥,趙加強,等. 百寶丹噴霧劑的抗炎鎮(zhèn)痛作用和急性毒性研究[J].中成藥，2013,35(5):911-914.

[2] 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(二部)[S]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：107-116.

[3] 王強，徐國鈞，程永寶，等. 中藥七葉一枝花類的抑菌和止血作用研究[J].中國藥科大學學報，1989,20(4)：251-253.

[4] 歐陽錄明，黃曉敏，吳興無，等. 中草藥體外抗白色念珠菌的實驗研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2000,7(3)：26-27.

(責任編輯：余 婷)

Validation of Microbial Limit Tests of Baibaodan Spray

Zhao Jiaqiang1,Zhou Rongguang1,2*,Yang Zhaoxiang1,Li Cuie2，Gao Hongtao1

(1.Institute for Drug Research and Development of Kunming Pharmaceutical Corporation, Kunming 650100, China;2.School of Pharmaceutial Science, Kunming Medical University, Kunming 650500, China)

Objective:To establish a microbial limits testing methods for Baibaodan spray.Methods:Referring to Chinese Pharmacopoeia (2010 edition ) ，the validation of counting method of bacteria，mold and yeast，and the validation of control bacteria check method was done in accordance with the conventional method and the medium dilution method. Results:Using the culture medium dilution method(0.2mL/dish) ，the recovery rates of 5 test microorganisms were all more than 70%.StaphylococcusaureusandPseudomonasaeruginosacan be detected by the medium dilution method(testing solution 10mL plus culture medium 800mL). Conclusion:The medium dilution method could be used for microbial llimit tests of Baibaodan spray.

Baibaodan Spray；Microbial Limit Test;Methodology Validatio

2015-06-15

云南省科技計劃項目(2013FZ260)

趙加強，男，昆明制藥集團股份有限公司工程師，研究方向為藥物質量。

周榮光,男，昆明制藥集團股份有限公司高級工程師，昆明醫(yī)科大學碩士生導師，研究方向為藥物制劑。E-mail:rgzhousy@163.com

R284.1

A

1673-2197(2015)21-0023-03

10.11954/ytctyy.201521010