雞傳染性貧血病毒VP1、VP2基因的表達及免疫原性研究

徐 微，李啟紅，李 嶺，孫 淼，李俊平，楊承槐，李慧姣

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

雞傳染性貧血病毒VP1、VP2基因的表達及免疫原性研究

徐 微，李啟紅，李 嶺，孫 淼，李俊平，楊承槐?，李慧姣?

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

為探索雞傳染性貧血重組蛋白亞單位疫苗的可行性，將雞傳染性貧血病毒基因分別克隆到轉移載體pFastBacHTA中，再將其分別轉化DH10Bac感受態(tài)細胞得到相應的重組表達載體，轉染昆蟲細胞Sf21獲得含有VP1、VP2基因的重組桿狀病毒vBac－VP1、vBac－VP2，應用懸浮培養(yǎng)的Sf21細胞表達重組蛋白。SDS－PAGE及Western blotting結果證明，VP1、VP2基因在昆蟲細胞中得到了表達，動物試驗進一步證實，重組蛋白免疫SPF雞可產生ELISA抗體，提示桿狀病毒表達的VP1、VP2具有良好的免疫原性。

雞傳染性貧血病毒；桿狀病毒表達；VP1；VP2；免疫原性

雞傳染性貧血（chicken infectious anemia，CIA）又稱藍翅病，是由圓環(huán)病毒科雞傳染性貧血病毒（CIAV）引起的以雛雞再生障礙性貧血和全身性淋巴組織萎縮為主要特征的免疫抑制病［1］。CIAV于1979年由Yuasa等人首次發(fā)現并分離［2］，其后迅速傳至世界各地，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大損失，被列為世界重要禽病研究行列。

CIAV的基因組是一環(huán)形、單股、負鏈DNA，大小約為2.3 kb。全基因組包括部分重疊或完全重疊的三個開放讀碼框架（open reading frame，ORFs），分別由1347、648、363 nt組成，編碼著VP1（52 kD）、VP2（24 kD）和 VP3（14 kD）蛋白［3］。VP1蛋白是CAV的唯一衣殼蛋白和主要免疫原蛋白，而VP2是VP1的輔助蛋白，能幫助VP1形成正確的構象，二者相互協調才能誘導機體產生免疫保護作用［4］。據國內外學者報道，單獨表達的 VP1蛋白抗體反應較弱［5］，共同表達的VP1、VP2蛋白具有確實的免疫原性［6］，如利用桿狀病毒在貼壁培養(yǎng)的 Sf9中表達 CIAV M9905株的 VP1、VP2蛋白［7］，但目前尚無將VP1、VP2重組蛋白與實際疫苗生產實踐相結合的報道。故本實驗旨在通過利用基因工程技術，將雞傳染性貧血病毒cux－1株的VP1、VP2的基因分別單獨連接到載體中，采用重組桿狀病毒表達系統在懸浮培養(yǎng)的昆蟲細胞Sf21中表達目的蛋白，將獲得目的蛋白進行純化和功能鑒定后，按照生物制品標準規(guī)程制備油乳劑滅活疫苗用于免疫動物并分析免疫效果，借以研究重組蛋白的免疫原性和分析用作亞單位疫苗的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、菌種和實驗動物 轉移載體質粒pFastBacHTA（pFBH）由本室保存，pFBH－VP1、pFBH－VP2插入基因分別為CIAV cux－1株的VP1、VP2基因；TOP10感受態(tài)細胞，購自北京天根生化科技有限公司，DH10Bac大腸桿菌感受態(tài)細胞由北京畜牧獸醫(yī)研究所李剛教授惠贈；SPF雞購自梅里亞維通實驗動物技術有限公司。

1.1.2 主要試劑 限制性內切酶EcoR I、SpeI、XhoI、KpnI，T4連接酶購自NEB公司，Ex Taq試劑盒購自大連 TaKaRa生物工程公司，轉染試劑LipofectaminTM2000購自 Invitrogen公司，昆蟲細胞培養(yǎng)基Sf900 II SFM、Grace’s購自GIBCO BRL公司，胎牛血清購自Hyclone公司

1.1.3 試劑盒 高純度質粒小提中量試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，Wizard Genomic DNA Purification Kit購自Promega公司，CIAV抗體檢測試劑盒購自北京天之泰生物科技有限公司。

1.1.4 CIAV及其陽性血清 CIAV cux－1株由本室保存，其多克隆陽性血清購自Charles river laboratories。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據已發(fā)表的基因組序列，設計擴增雞傳染性貧血病毒cux－1株的VP1及VP2基因引物，由上海生工生物工程有限公司合成。VP1－F：5’－CCGGAATTCGCCACCATGGCAAGACGAGCTCGCAGAC－3’，VP1－R：5’－CTA?GACTAGTCCTTAGGGCTGCGTCCCCCAG－TACATG－3’，VP2－F：5’－CCGCTCGAGGATGCACGGGAACG?GCGCACAAC－3’，VP2－R：5’－GGGG－TACCCCT?TACACTATACGTACCGGGG－3’，其中VP1上下游分別引入EcoR I、SpeI酶切位點，VP2上下游分別引入XhoI、KpnI酶切位點。

1.2.2 DNA模板提取 采用Wizard Genomic DNA Purification Kit進行。

1.2.3 VP1基因的克隆 PCR反應體系：CIAV DNA 2 μL，dNTPs 2 μL，10×Ex Taq buffer 2.5 μL，引物VP1－F和VP1－R各1 μL，Ex Taq DNA聚合酶0.125 μL，ddH2O 16.375 μL，總體積25 μL。反應條件：94℃預變性3 min，94℃變性40 s，62.8℃退火40 s，72℃延伸1 min 30 s，30個循環(huán)后，72℃延伸10 min。

1.2.4 VP2基因的克隆 PCR反應體系：CIAV DNA 2 μL，dNTPs 2 μL，10×Ex Taq buffer 2.5 μL，引物VP2－F和VP2－R各1 μL，Ex Taq DNA聚合酶0.125 μL，ddH2O 16.375 μL，總體積25 μL。反應條件：94℃預變性3 min，94℃變性40 s，62.8℃退火40 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)后，72℃延伸10 min。

1.2.5 基因測序及序列分析 PCR產物用膠回收試劑盒回收后，分別連接到pMD18－T載體，轉化TOP10感受態(tài)細胞，獲得重組質粒pMD18T－VP1，pMD18T－VP2。將酶切及PCR鑒定正確的重組質粒送Invitrogen公司測序，并用序列分析軟件對測序結果進行分析。

1.2.6 重組轉移載體構建 pMD18T－VP1、pMD18T－VP2經測序正確后，使用限制性內切酶EcoR I、SpeI分別雙酶切pMD18T－VP1及轉移載體質粒 pFastBacHTA后連接，獲得重組轉移載體pFBH－VP1；使用限制性內切酶XhoI、KpnI分別雙酶切pMD18T－VP2及轉移載體質粒pFastBacHTA后連接，獲得重組轉移載體pFBH－VP2。以上重組載體均用雙酶切及PCR鑒定。

1.2.7 重組表達載體構建 重組轉移載體鑒定正確后，將 pFBH－VP1、pFBH－VP2分別轉化DH10Bac大腸桿菌感受態(tài)細胞，經藍白斑和慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素三抗篩選之后，獲得重組表達載體Bacmid DNA，使用M13通用引物與VP1、VP2基因特異引物進行PCR鑒定。

1.2.8 重組桿狀病毒產生 經鑒定載體重組正確后，按照LipofectaminTM2000操作說明，將Bacmid－VP1、Bacmid－VP2分別轉染Sf21昆蟲細胞，混合孵育5 h后棄去轉染混合物，加入Sf900 II SFM培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)至細胞出現明顯的細胞病變時，收集培養(yǎng)液，1500 r／min離心10 min后收集上清，加入2%～4%的胎牛血清，4℃避光保存，即為 P1代毒。按MOI＝0.1將P1代毒接種處于對數生長期（密度為1×106～2×106細胞／mL）的Sf21細胞，28℃培養(yǎng)72 h收獲P2代毒，同樣方法接P2代毒，收獲P3代毒，用于重組蛋白表達。

1.2.9 重組桿狀病毒鑒定 提取病毒液中的病毒DNA，用M13通用引物與VP1、VP2基因特異引物進行PCR鑒定。

1.2.10 重組蛋白表達及鑒定 將懸浮培養(yǎng)的Sf21細胞調整至對數生長期后，按MOI＝5接種P3代毒，將重組桿狀病毒vBac－VP1、vBac－VP2共同感染細胞，于28℃ 125 r／min搖床中培養(yǎng)，24、48、72、96、120和144 h分別收獲細胞及上清，裂解后用10%的分離膠進行SDS－PAGE蛋白電泳，分別考馬斯亮藍染色及Western blotting觀察結果。

1.2.11 重組蛋白免疫原性研究 按照生物制品標準規(guī)程將vBac－VP1、vBac－VP2共感染表達產物制成油乳劑滅活疫苗。經胸部肌肉接種5周齡SPF雞三只，同時設等量對照。于免疫后21 d采血并分離血清，利用ELISA試劑盒檢測抗體效價。

2 結果

2.1 VP1、VP2基因的PCR擴增 分別使用VP1、VP2特異性引物對病毒DNA模板進行擴增，擴增產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見分別出現1350 bp及651 bp片段，與預期片段大小相符（圖1和圖2）。

圖1 VP1基因的PCR擴增結果

圖2 VP2基因的PCR擴增結果

2.2 基因測序及序列分析 使用序列分析軟件對重組質粒pMD18T－VP1、pMD18T－VP2測序結果進行分析，得到二者與目的基因同源性均達到99%。

2.3 重組轉移載體鑒定 利用各載體特異性的限制性內切酶酶切鑒定及 PCR鑒定結果均表明，CIAV的VP1、VP2基因正確插入各重組質粒的多克隆位點，且方向正確。

2.4 重組表達載體鑒定 重組轉移載體轉化DH10Bac細胞經藍白斑篩選后，提取桿粒，利用用M13通用引物與VP1、VP2基因特異引物進行PCR鑒定，Bacmid－VP1經M13－F／VP1－R為引物擴增后出現 3100 bp片段，與理論值相符（圖 3）；Bacmid－VP2經M13－F／VP2－R為引物擴增后出現2478 bp片段，與理論值相符（圖4），證明重組表達載體正確構建。

圖3 Bacmid－VP1的PCR鑒定結果

圖4 Bacmid－VP2的PCR鑒定結果

2.5 重組桿狀病毒構建 對收獲的細胞培養(yǎng)上清提取病毒DNA，利用M13通用引物與VP1、VP2基因特異引物進行PCR鑒定。

2.6 重組蛋白的鑒定 分別于感染后24、48、72、96、120和144 h收獲三種不同表達載體感染Sf21細胞所得產物，SDS－PAGE電泳分析表明，重組桿狀病毒vBac－VP1、vBac－VP2共同感染細胞后72 h開始表達目的蛋白VP1、VP2，大小分別為60 kD和29 kD左右，直至140 h仍有表達（圖5），經Western blotting分析，均出現與預期大小相符的條帶。

圖5 重組桿狀病毒vBac－VP1、vBac－VP2共同感染表達產物

2.7 重組蛋白的免疫原性 經ELISA試劑盒檢測，對照組全部為陰性，免疫組全部為陽性，平均抗體效價9966。

3 討論

CIAV感染雛雞可引起嚴重貧血，滲出性皮炎和死亡，特別是導致全身性淋巴組織萎縮引起免疫抑制而繼發(fā)感染或二重感染，降低其它疫苗的免疫效果。野生型CIAV雖然能在MDCC－MSB1細胞或雞胚上增殖，但通過MSB1細胞連續(xù)傳代降低其毒力后對于雛雞來講致病性仍然較強，比如國外生產的Cux－1株弱毒苗，接種雛雞仍然可以導致CIA的發(fā)生［8］；另一方面，CIAV在MSB1細胞中病毒滴度較低，而通過雞胚傳代獲得的病毒量也不高，使CIA滅活疫苗的生產成本很高，難以在養(yǎng)雞業(yè)大量推廣應用，同時CIAV對各種理化因子具有很強抵抗性而很難將其全部滅括，在其他常規(guī)雞胚苗的生產過程中，往往有活的CAV存在，引起嚴重的二次感染，因此，給常規(guī)疫苗的研制帶來了很大困難。故近年來，基因工程疫苗研制已成為CIAV研究的重點領域之一，如哺乳動物細胞表達［9］以及在家蠶中的表達［8］。

本研究所使用的桿狀病毒表達系統（baculovirus expression vector system，BEVS）是一個利用桿狀病毒作為載體，在昆蟲培養(yǎng)細胞或蟲體中表達外源蛋白的真核表達系統。具有安全性高、真核修飾環(huán)境、容量大、表達量高等特點，自 Smith GE等于1983年利用AcNPV成功表達外源蛋白以來，經過30年的發(fā)展，桿狀病毒表達系統已經成為當今基因工程四大表達系統（桿狀病毒、大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞表達系統）之一。

本研究利用Bac－to－Bac桿狀病毒表達系統，成功構建單獨表達CIAV VP1、VP2基因的重組桿狀病毒 vBac－VP1、vBac－VP2。利用 vBac－VP1、vBac－VP2共同感染細胞后收獲表達產物，經SDSPAGE蛋白電泳分析表明重組表達蛋白VP1、VP2大小分別為 60 kD和 29 kD左右，經 Western blotting分析證明，重組VP1、VP2蛋白能與CIAV陽性血清發(fā)生特異性免疫反應，具有良好的抗原性。將重組表達產物制備為油乳劑滅活疫苗免疫SPF雞，21 d后ELISA檢測抗體轉陽，這說明桿狀病毒表達的CIAV VP1、VP2蛋白具有良好的免疫原性，可誘導機體產生體液免疫應答。本研究初步證明采用Bac－to－Bac桿狀病毒表達系統表達的CIAV cux－1株VP1和VP2蛋白具有較好的免疫原性，且通過按照標準規(guī)程制備油乳劑滅活苗，進一步將重組蛋白表達與生產實際相聯系，具有較好的應用前景。故該重組蛋白可以用于中和抗體檢測，檢測群體的免疫水平，也為進一步開展亞單位疫苗生產奠定了基礎。

［1］李文濤，王宏偉，韓少杰.傳染性貧血病［J］.養(yǎng)禽與禽病防治，2005，10：36－37.

［2］Yuasa N，Taniguchi T，Yoshida I.Isolation and some properties of an agent inducing anemia in chicks［J］.Avian Disease，1979，23：366－385.

［3］翟新驗，盧勝明.雞貧血病毒［C］／／中國畜牧獸醫(yī)學會禽病學分會第十一次學術研討會論文集，2002：336－338.

［4］Koch G，van Roozelaar D，Verschueren C，et al.Immunogenic and protective properties of chicken anaemia virus proteins expressed by baculovirus［J］.Vaccine，1995，13：763－770.

［5］Guan－Hua Lai，Ming－Kuem Lin，Yi－Yang Lien，et al.Expression and characterization of highly antigenic domains of chicken anemia virus viral VP2 and VP3 subunit proteins in a recombinant E.coli for sero－diagnostic applications［J］.BMC Veterinary Research，2013，9：161.

［6］Mathieu H，Claudia A，Guus K，et al.Simultaneous expression of recombinantbaculovirusencoded chicken anaemia virus proteins VP1 and VP2 is required for formation of the CAV－specific neutralizing epitope［J］.Journal of General Virology，1998，79：3073－3077.

［7］鄢明華，趙曉巖，劉長軍，等.雞傳染性貧血病毒VP1、VP2基因在桿狀病毒表達系統中的表達［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2003，25（6）：426－429.

［8］黃建芳，張知良，趙寶華，等.雞貧血病毒VP1和VP2蛋白在家蠶中的聯合表達［J］.動物醫(yī)學進展，2002，2（3）：53－56.

［9］陳降華，李文平，周慶豐，等.雞傳染性貧血病毒VP1和VP2基因共表達載體的構建［J］.動物醫(yī)學進展，2009，30（11）：68－71.

（編 輯：李文平）

Expression of VP1 and VP2 Genes of Chicken Anemia Virus and Immunogenicity Research

XU Wei1，LI Qi－h(huán)ong，LI Ling，SUN Miao，LI Jun－ping，YANG Cheng－h(huán)uai?，LI Hui－jiao?
（China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing100081，China）

The VP1 and VP2 genes of chicken anemia virus were cloned into pFastBacHTA vectors separately，then transformed into competent cells ofE.coliDH10Bac.The recombinant baculoviruses vBac－VP1 and vBac－VP2were generated by transfection of recombinant bacmid into Sf21 insect cells.Finally，recombinant proteins were expressed in suspension culture Sf21 cells.SDS－PAGE and Western blotting showed that VP1 and VP2 have been expressed in Sf21 cells.Immunized the SPF chicken with recombinant protein，their serum were inspected by ELISA and showed good immunogenicity.

chicken anemia virus；baculovirus expression；VP1；VP2；immunogenicity

2014－10－10

A

1002－1280（2015）04－0007－05

S852.65

科技部科技基礎性工作專項“重大動物疫病病原及相關制品標準物質研究（2008FY130100）”

徐 微，碩士研究生，從事禽病研究。

楊承槐，E－mail：ychenghuai＠163.com；李慧姣，E－mail：lihuijiao＠ivdc.org.cn